鲤脾脏高丰度micoRNA let-7a序列特征、组织表达及功能预测分析

郭国军 赵银丽 刘变枝 王 杰 孙向丽 李国喜

(1. 河南牧业经济学院, 郑州 450046; 2. 河南农业大学, 郑州 450002; 3. 河南工业大学, 郑州 450001)

(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China; 2. Henan University of Agricultural,Zhengzhou 450002, China; 3. Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

鲤脾脏高丰度micoRNA let-7a序列特征、组织表达及功能预测分析

郭国军1赵银丽3刘变枝2王 杰2孙向丽2李国喜2

(1. 河南牧业经济学院, 郑州 450046; 2. 河南农业大学, 郑州 450002; 3. 河南工业大学, 郑州 450001)

先前研究表明let-7a为鲤(Cyprinus carpio)脾脏高丰度miRNA, 但其功能尚不清楚。为全面了解鲤let-7a的潜在生物学功能, 研究分析了其成熟序列特征、组织表达谱和靶基因富集情况。结果显示, let-7a在鲤脾脏中存在序列长度变异和碱基替换, 长度为18—25 nt, 碱基替换类型有9种, 种子区序列碱基替换率达2.1%。表达谱分析表明, let-7a为广泛性高丰度miRNA, 具明显的时序表达特征, 其在鳃、肠、脾脏和肾脏等免疫相关器官中的表达水平明显高于其他器官。GO富集分析显示, let-7a与转录调控、细胞刺激应答、离子转运、跨膜运输、蛋白质氨基酸磷酸化和细胞迁移等生物学过程密切相关, 尤其是靶基因GO term在刺激应答相关的许多生物学过程显著富集。总之, 鲤let-7a可广泛参与多种生物学过程调控, 尤其是机体各种刺激应答。

鲤; let-7a; 序列特征; 组织表达谱; 生物学功能

鲤(Cyprinus carpio)是重要的淡水经济养殖鱼类, 在中国其养殖产量约占淡水养殖鱼类总产量的30%。近年来, 随着高密度精养的快速发展, 传染性疾病的暴发日益严重, 已影响到该物种的生产。因此, 鲤的抗病育种越来越受到关注。在天然条件下, 鱼类主要依赖于非特异性免疫应答快速清除病原体而抵抗疾病[1]。因此, 疾病预防的一个重要途径就是采用分子育种方法培育对主要疾病具有抵抗力的品种。但目前, 有关鲤抗病性状的研究还处于初级阶段, 许多抗病性状还没有很好的分子标记,至使分子育种技术在鲤育种实践中还得不到广泛应用。

MicroRNA(miRNA)是内源性非编码小RNA,其通过与mRNA的3′-UTR中靶位点结合而从转录后水平调控基因表达, 参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等许多生物学过程调节[2], 已成为解析动物性状形成的一个新靶点。许多研究已证实,miRNA在免疫系统自身发育以及免疫相关的许多生物学过程发挥重要作用[3,4]。脾脏是鱼类的二级淋巴样免疫器官, 在疾病过程可通过T细胞和B细胞等免疫细胞消灭抗原, 防御来自血液的病原体,在细菌感染过程发挥重要作用[5]。因此, 脾脏是鉴定鱼类免疫相关分子标记的一个理想器官。为从转录后水平解析鲤脾脏发育的分子机制和鉴定免疫相关分子标记, 前期构建了黄河鲤(Cyprinus carpio haematopterusTemminck)脾脏的miRNA表达谱,从中鉴定到194种保守miRNA和12种新miRNA[6]。但目前尚不清楚这些miRNA在鲤脾脏中的功能。

Let-7家族是研究最为广泛的miRNA之一。2000年, 由Reinhart等[7]首次在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现, 研究证明其参与线虫发育时序性调控。随后, let-7在果蝇(Drosophila melanogaster)、小鼠(Mus musculus)和人类(Homo sapiens)等多个物种中陆续被发现, 其序列高度保守并广泛存在于无脊椎动物到脊椎动物的许多物种中。有关let-7生成、加工、表达调控和生物学功能的相关研究已很多, 这些研究表明let-7家族广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、免疫应答、肿瘤发生等多种生理病理过程的调控[8,9]。其中, 免疫方面的一些研究显示, let-7可调控生物体对细菌感染的免疫应答[10], 通过调控白细胞介素[11—14]、细胞活素[15]和Toll-like受体[16,17]等免疫相关因子的表达而影响机体免疫, 这说明let-7家族与动物免疫密切相关。因此, 深入研究let-7家族在鱼类免疫中的调控功能, 有助于免疫相关分子标记的发掘。但目前有关鱼类let-7家族的研究还仅见于斑马鱼(Danio rerio)[18]和牙鲆(Paralichthys olivaceus)[19,20]等少数报道。本实验室前期从黄河鲤脾脏组织miRNA表达谱中检测到了let-7家族的9个成员, 其中let-7a的测序读数占整个文库序列读数的37.61%[6], 为高丰度miRNA, 但其功能尚不明确。本研究分析了let-7a在鲤脾脏中的序列特征、组织表达谱和预测靶基因富集情况, 并整合上述3种结果探讨了鲤let-7a的潜在生物学功能, 以期增加对鲤let-7a生物学功能的全面理解和为后续功能研究提供有益线索。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

采用黄河鲤进行let-7a的组织表达谱分析, 试验用鱼来自河南省水产科学研究院下属的黄河鲤良种场, 为室外池塘养殖。分别取1龄和3龄黄河鲤各3尾, 解剖后采集脑、鳃、肌肉、心脏、脾脏、肠、肾脏和肝胰脏等组织, 用液氮迅速冷冻后保存于–80℃冰箱中备用。

1.2 试验方法

总RNA提取与加尾 采用Trizol试剂(TaKaRa公司), 按照产品操作说明提取黄河鲤各组织的总RNA, 分别利用1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测总RNA的完整性和浓度。let-7a实时定量PCR分析采用加尾法, 反转录前在RNA两端加poly (A)尾, 反应体系为20 μL, 其中总RNA 4 μL、10×buffer 2 μL、ATP (10 umol/L) 2 μL、E. coliPoly(A) Polymerase (5 U/μL, NEB公司) 2 μL、H2O 10 μL, 上述试剂混合后于PCR仪上37℃孵育60min。

反转录反应利用primerScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa公司)对黄河鲤各组织总RNA进行反转录, 反应体系: 反转录引物(10 μmol/L) 2 μL、加尾后的总RNA 2 μL、5×PrimeScript Buffer 4 μL、dNTP Mixture (2.5 mmol/L each) 4 μL、DTT(0.1 mol/L) 2 μL、PrimeScript Rtase (200 U/μL)1 μL、H2O (RNase Free) 5 μL。依次加入各试剂,混匀后, 在42℃ 60min、85℃ 5min条件下进行反应, 结束后于冰上冷却终止反应。所用反转录引物为5′-CTCGATCCAGTCTCAGGGTCCGAGGT ATTCGATCGAGTCGCACTTTTTTTTTTTTTTTT-3′。

let-7a荧光定量PCR分析在Roche Light-Cycler®480Ⅱ实时定量检测PCR仪上进行荧光定量PCR分析, 反应体系20 μL: 反转录产物1 μL、上游特异性引物(10 μmol/L) 1 μL、下游通用引物(10 μmol/L) 1 μL、2×SYBR热启动预混酶10 μL、H2O 7 μL。反应条件为: 95℃ 10min; 95℃ 15s,60℃ 1min, 共40个循环。于62℃采集荧光, 采用默认设置自动生成Ct值。各组织样品重复3次。反应中, let-7a上游特异性引物为5′-CGGTGAGGT AGTAGGTTGTATAG-3′, 下游通用引物为5′-CCAGTCTCAGGGTCCGAG-3′。同时, 按照相同条件对5S RNA进行荧光定量PCR分析, 所用引物为: 上游5′-ACGGCCATACCACCCTGAGC-3′、下游5′-GTATTCCCAGGCGGTCTCCC-3′。以5S RNA为内参对照、1龄鲤肌肉组织为校准样品, 利用各组织样品三次重复的平均Ct值, 采用2–ΔΔCt法计算鲤各组织中let-7a的相对表达量。

let-7a成熟序列碱基编辑分析以实验室构建的鲤脾脏小RNA文库为基础, 将Solexa高通量测序获得的未被注释的小RNA序列与miRBase数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)中鲤let-7a的成熟序列进行比对, 在允许特定位点存在一个碱基错配的条件下, 分析与let-7a已知序列相匹配的小RNA序列, 从而检测let-7a成熟序列的碱基编辑情况。

let-7a靶基因预测、通路分析和GO term 富集

本研究基于相近物种间基因3′-UTR靶位点高度保守的原理, 利用TargetScan Release 6.2 (http://www.targetscan.org/fish_62/)中斑马鱼的资源, 预测了鲤let-7a的靶基因。利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)中的Functional Annotation Tool对let-7a的预测靶基因进行Gene Ontology(GO)分析和通路分析, 显著性富集标准是校正P≤0.05。利用GENERIC GENE ONTOLOGY(GO)TERM FINDER在线工具(http://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermFinder), 采用ZFIN-D.rerio (Zebrafish)为背景集, 以P＜0.05为显著性标准,对let-7a的预测靶基因进行分层富集。

2 结果

2.1 鲤脾脏中let-7a成熟序列特征

基于前期构建的鲤脾脏小RNA文库和Solexa测序数据, 分析了let-7a的序列特征。结果表明,鲤脾脏中let-7a成熟序列长度在18—25 nt, 多数为22 nt (80.6%), 其次为23 nt (10.2%)、21 nt (7.3%)、20 nt (1.3%); 长度变异主要发生在3′末端, 主要形式有修饰和(或)核苷酸添加(图1)。

图1 鲤脾脏组织中let-7a序列长度变异Fig. 1 Let-7a sequence length difference in the spleen tissue of common carp

另外, 在文库中共检测到5915316条与let-7a相匹配的小RNA序列存在多态现象, 其碱基替换类型有9种, 包括A-＞C、A-＞G、A-＞T、G-＞A、G-＞C、G-＞T、T-＞A、T-＞C和T-＞G等, 这些碱基替换类型占所有替换类型总计数的百分比分别为0.01%、0.40%、0.03%、11.70%、0.03%、4.05%、0.15%、0.10%和0.24%, 其中优势类型为G-＞A和G-＞T。碱基替换发生在let-7a成熟序列的第5到第20位碱基处, 主要是第12、第19和第6位碱基处, 分别占93.9%、2.0%和1.7%。成熟miRNA的5′端第2至第8位碱基称为种子序列(Seed sequence), 该区域是miRNA与靶mRNA的结合部位, 本研究从文库中共检测到20802条与let-7a相匹配的小RNA序列, 它们的第5至第8位处存在碱基编辑现象, 占2.1%。

2.2 鲤let-7a的组织表达谱

由图2可知, let-7a在所检测的8种鲤组织中均有表达。在设定阈值为2.8576条件下, 1龄鲤各组织实时定量PCR分析的平均Ct值为13.45—16.57,3龄鲤各组织的平均Ct值为13.00—18.93, 这说明let-7a在鲤不同发育阶段的各组织中均高丰度表达。从相对表达量看, let-7a在鳃、脑、肠、脾脏和肾脏中的表达水平明显高于心脏、肝胰脏和肌肉中的表达水平, 其中1龄鲤脾脏最高, 肌肉最低(图2)。

同时, let-7a的表达呈现明显的时序特征。除肝胰脏外, 随着生长发育let-7a在鲤各组织中的表达水平均降低, 1龄鲤明显高于3龄鲤(图2)。在脑组织, let-7a在1龄和3龄鲤均高丰度表达, 1龄鲤稍高于3龄鲤。在鳃、肠、脾脏和肾脏中, let-7a的表达水平在两个发育阶段差异显著, 1龄鲤鳃、肠、脾脏和肾脏中let-7a的表达量分别是3龄鲤的5.3、2.4、2.4和1.4倍。

2.3 鲤let-7a的功能预测分析

为更好地理解鲤let-7a的生物学功能, 采用TargetScan算法预测到了2381个let-7a的潜在靶基因(结果未显示)。GO富集分析显示, 这些预测靶基因与广泛的生物学过程相关, 涉及转录调控、细胞刺激应答、离子转运、跨膜运输、蛋白质氨基酸磷酸化、细胞迁移、大分子复合物装配等特定的生物学过程(表1)。其中, 在有机物的细胞应答、内源性刺激的细胞应答和有机环状化合物的细胞应答等相关生物学过程中, 累计富集基因占总预测靶基因的比例分别为5.5%、4.5%和2.4%(表1)。

图2 鲤let-7a的组织表达谱Fig. 2 Tissue expression patterns of the let-7a in common carp

表1 let-7a预测靶基因在生物学过程分类范畴中富集的GO termTab. 1 GO term enrichment for the predicted target genes of let-7a in biological process category

由于细胞应答与机体防御密切相关, 为了解let-7a调控鲤刺激应答的更多信息, 利用GO Term Enrichment tool对let-7a的预测靶基因重新进行了分层富集。结果显示, 这些靶基因的GO term在化学刺激应答、刺激的细胞应答、对含氮化合物应答、对含氧化合物的应答、刺激应答调控、对生长因子的应答、对肽类激素的应答、对胰岛素的应答和转化生长因子β刺激的细胞应答等特定生物学过程中显著富集(图3)。同时, 这些预测靶基因具有DNA结合、转录因子活性、蛋白激酶活性、离子通道活性、磷酸酶活性和生长因子活性等多种分子功能(表2)。

另外, 利用DAVID生物信息学资源对预测靶基因也进行了通路分析, 结果显示这些预测靶基因的GO term在MAPK信号通路、Wnt信号通路和TGF-beta信号通路等通路中显著富集(表3)。

3 讨论

研究表明, 动物许多miRNA的表达具有明显的种属和组织特异性, 这些miRNA在特定组织器官的特定发育阶段大量表达, 参与相应生物学功能的调节。因此, 明确特定组织器官或特定发育阶段miRNA的表达谱, 将有助于揭示特定组织器官发育的分子调控机制。本研究结果表明, let-7a在所检测的8种鲤组织中均高丰度表达, 且随着发育机体生理功能趋于完善稳定, 其表达量相对降低(肌肉组织除外), 呈现明显的时序特征(图2); 而靶基因预测分析也显示, 鲤let-7a与转录调控、细胞刺激应答、离子转运、跨膜运输、细胞迁移等多种生物学过程密切相关(表1)。这些说明, 本研究的组织表达谱与靶基因预测分析结果高度一致, 同时也提示let-7a在鲤中可能具有广泛的生物学功能。

在生物体内, 一个miRNA可能作用于多个靶基因, 或多个miRNA调控一个靶基因, 共同构成一个网络, 从整体上调控有机体的生命活动[21]。另外,机体内miRNA靶基因的结合位点经常存在多态现象, 如Lin28基因中let-7结合位点的多态性与Ⅱ型糖尿病发病风险有关[22]; KRAS 3′-UTR中let-7结合位点的多态性与多种癌症有关[23,24]。基于miRNA靶基因的多样性, 机体内miRNA常常存在序列长度变异和碱基编辑情况。其中, 长度和/或末端序列变异可影响miRNA/靶基因mRNA杂交双链体的形成,从而使miRNA能够执行不同的功能[25]; 而成熟miRNA的5′端种子区(也叫miRNA seed)序列的碱基变化可导致miRNA靶位点的变化[26]。本研究利用Solexa测序数据分析了鲤脾脏中let-7a的长度变异和碱基编辑情况, 发现let-7a序列末端存在修饰和(或)核苷酸添加现象(图1), 长度在18—25 nt; 同时,let-7a成熟序列第5至第20位碱基处存在9种类型的碱基替换, 而种子区序列的替换率达2.1%。据研究, 机体内A-＞G替换是由腺苷脱氨酶(ADARs)催化的A-to-I脱氨基作用引起[27—29], 而其他类型的碱基替换可能是由RNA的转录后修饰产生[30]。因此, 鲤脾脏中let-7a序列长度变异与碱基编辑, 增加了let-7a及其靶基因的多样性, 扩大了let-7a的功能范围,是let-7a功能多样性的基础。

揭示鱼类免疫调节分子机制和鉴定免疫相关分子标记, 是鱼类抗病育种的关键。先前相关研究证明, let-7家族的一些成员可参与免疫调控。例如,let-7通过调控NF-κB通路抑制者A20而调节对结核分支杆菌感染的免疫应答[10]; let-7a在裸鼠中可抑制k-Ras和c-Myc的表达而保护肺癌的生长[31]; let-7c在Jurkat细胞中可直接靶作用于IL-10而调控IL-10的表达[11]; let-7i通过靶作用于Toll-样受体4(TLR4)而降低其表达, 从而促进免疫应答[32]。而本研究结果与先前这些研究结果也高度一致, 组织表达谱显示let-7a在鲤鳃、肠、脾脏和肾脏等免疫相关组织器官中高丰度表达(图2), 其预测靶基因在化学刺激应答、含氮化合物刺激应答、含氧化合物刺激应答、生长因子刺激应答、肽类激素刺激应答等机体防御相关的生物学过程中显著富集(图3), 这证明let-7a与鲤免疫功能调控密切相关。根据预测靶基因富集分析可知, let-7a对鲤免疫功能的调控, 可能是通过转录因子活性、蛋白激酶活性和生长因子活性等多种分子功能(表2)以及MAPK、Wnt和TGF-beta等信号通路(表3)来实现的。因此, 可以将let-7a作为鲤免疫调控的一个新靶标, 进一步深入研究其在上述免疫防御相关生物学过程中的作用与机制, 为鲤抗病育种分子标记筛选提供基础。

总之, 上述let-7a的功能预测分析结果与其序列特征和组织表达谱相一致。整合3种分析结果可以看出, 鲤let-7a为广泛性普遍表达miRNA, 可参与转录、离子转运、跨膜转运、细胞迁移、戊糖磷酸支路等诸多生物学过程调控, 尤其是机体各种刺激应答。本研究所得结果, 为进一步研究鲤let-7a的功能提供了有益线索。

图3 与刺激应答相关的GO term项的分层富集Fig. 3 Stratified enrichment of GO terms related to the stimulus response

表2 let-7a预测靶基因在分子功能分类范畴中富集的GO termTab. 2 GO term enrichment for the predicted target genes of let-7a in molecule function category

表3 let-7a预测靶基因富集的通路Tab. 3 The enrichment pathway for the predicted target genes of let-7a

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SEQUENCE CHARACTERISTIC, TISSUE EXPRESSION PROFILE AND BIOINFORMATICS ANALYSIS OF ABUNDANCE MICORNA LET-7A IN THE SPLEEN OF COMMON CARP

GUO Guo-Jun1, ZHAO Yin-Li3, LIU Bian-Zhi2, WANG Jie2, SUN Xiang-Li2and LI Guo-Xi2

Previous studies have shown that the let-7a was an abundance miRNA in the spleen of common carp, but its function in the carp spleen is still not clear. Therefore, in this study, the characteristic of let-7a mature sequence were analyzed, the expression profiles of let-7a were determined by RT-qPCR in eight tissue samples at two stages of development, and the bioinformatic analysis were performed for the predicted target gene of let-7a. The results showed that the let-7a existed sequence length variation and base substitution in the spleen of common carp. The let-7a length ranged from 18 nt to 25 nt, and the base substitution types of its mature sequence had nine. Especially, the base substitution rate in seed sequence was 2.1%. The expression profile analysis showed that the let-7a as a generalized high abundance miRNA exhibited striking temporal expression characteristics. The let-7a expression levels in the immunity related organs including gill, intestine, spleen and kidney were significantly higher than those in the other organs. GO enrichment analysis suggested that the let-7a significantly involved in the regulation of transcription, cellular response to stimulus, ion transport, transmembrane transport, protein amino acid phosphorylation, cell motion, and so on. Especially, the predicted target genes of let-7a were significantly enriched in many biological processes of stimulus response. In a word, let-7a can widely participate in the regulation of various biological processes, especially in the stimulus response of the body in common carp.

Common carp; let-7a; Sequence characteristic; Tissue expression profile; Biological function

Q344+.1

A

1000-3207(2017)06-1177-09

2017-01-03;

2017-04-22

国家自然科学基项目(31572356)资助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31572356)]

郭国军(1973—), 男, 河南中牟人; 在读博士; 研究方向为水产养殖学。E-mail: 306301974@qq.com

李国喜, 副教授; E-mail: liguoxi0914@126.com

10.7541/2017.146

(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China; 2. Henan University of Agricultural,Zhengzhou 450002, China; 3. Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)