7种生物碱在不同粒径卷烟主流烟气气溶胶中的分布研究

朱 琴，刘志华，朱瑞芝，杨国荣，张凤梅，张建荣，王亚明，司晓喜*

(1.昆明理工大学 化学工程学院，云南 昆明 650500；2.云南省烟草化学重点实验室，云南中烟工业有限责任公司 技术中心，云南 昆明 650231)

实验技术

7种生物碱在不同粒径卷烟主流烟气气溶胶中的分布研究

朱 琴1,2，刘志华2，朱瑞芝2，杨国荣2，张凤梅2，张建荣2，王亚明1*，司晓喜2*

(1.昆明理工大学 化学工程学院，云南 昆明 650500；2.云南省烟草化学重点实验室，云南中烟工业有限责任公司 技术中心，云南 昆明 650231)

建立了烟气气溶胶中7种生物碱的气相色谱-质谱(GC-MS)测定方法，并采用电子低压撞击器(ELPI)分12级捕集烟气气溶胶粒相物，研究了卷烟主流烟气气溶胶中7种生物碱含量和浓度的粒径分布。捕集的气溶胶样品加入氢氧化钠溶液和二氯甲烷进行碱法提取，提取液经DB-5MS弹性毛细管柱分离，选择离子监测模式测定，内标法定量。结果表明：该法检测主流烟气气溶胶中7种生物碱的相对标准偏差(RSD)为2.1%～6.4%，检出限为0.39～14.84 ng/cig，加标回收率为85.5%～124.8%。7种生物碱主要分布于0.144～0.722 μm的中等粒径气溶胶粒相物中，在粒径0.431 μm的粒相物中含量最高，与捕集的粒相物质量分布一致。7种生物碱在不同粒径气溶胶粒相物中的浓度基本趋于一致，其浓度随气溶胶粒径的分布无特异性。

主流烟气；气溶胶；生物碱；粒径分布；气相色谱-质谱法

烟草生物碱是极为重要的烟气化学成分，包括烟碱、降烟碱、麦斯明、烟碱烯、新烟碱、2,3′-联吡啶、可替宁等，这些生物碱主要源于烟叶中生物碱的热解转化和直接转移[1]，直接影响烟气化学性质和感官特征，是烟草制品满足感和愉悦感的主要来源[2-3]。

烟气气溶胶中的化学成分随烟气粒相物的粒径大小呈不同分布，而粒径大小会影响烟气粒相物在呼吸系统的沉积部位及烟气感官质量[4]。生物碱主要分布在卷烟烟气的粒相物中，由于不同粒径的烟气粒相物在人体呼吸道的沉积作用不同[4]，生物碱在不同粒径粒相物中的分布特征会影响其进入人体肺部时的部位和总量，进而改变生物碱的吸入量和向大脑的传递速率，并影响生物碱对人体的成瘾性和心血管效应等[5-6]。因此研究生物碱在不同粒径卷烟烟气粒相物中的分布，将更全面地展示其与人体生物效应、烟气安全性等的联系。

目前对烟气气溶胶中生物碱只开展了烟碱的粒径分布方面的研究。Morie等[7]采用阶式碰撞取样器从0.25 μm 到1.0 μm分4个粒径级别捕集未稀释的卷烟烟气，发现烟碱含量、烟碱在单位质量粒相物中的比例(即浓度)均呈先增大后减小的趋势，在中间粒径0.5 μm 和0.75 μm的粒相物中达最大值。Ishizu等[8]采用气溶胶光谱仪研究发现烟碱主要富集在0.08 μm的卷烟气溶胶粒相物中。Wang等[9]采用电子低压撞击器(ELPI)分级捕集经压缩空气稀释的卷烟气溶胶，发现烟碱主要分布在气溶胶粒径为0.14～0.72 μm的粒相物中，并呈先增加后减小的趋势，但烟碱在小于0.1 μm、0.1～1.0 μm和大于1.0 μm 3个粒径级别中的浓度差别较小。由此可见，不同测定方法均显示烟碱集中分布在中间粒径(0.1～1.0 μm)的粒相物中，但不同研究中烟碱浓度的粒径分布不同，可能由于捕集条件如卷烟抽吸方式、烟气进行稀释或不稀释、实验的温度和湿度、卷烟设计等的差异，导致研究结果存在差异[10]。进一步详细研究多种生物碱在不同粒径烟气气溶胶的分布情况，将为评价生物碱对人体的作用以及卷烟设计提供支持。

烟草生物碱通常与有机酸或无机酸结合以盐的形式存在，只有少数生物碱以游离碱、糖苷、有机酸酯或酰胺的形式存在[11]。由于烟草生物碱存在形式的多样性，其提取方法较多，主要有水提取法、有机溶剂提取法、碱提取法和酸-碱提取法等[12]。烟气中生物碱的分析方法主要有气相色谱法[13]、液相色谱法[14]、气相色谱-质谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[15]、气相色谱-串联质谱法[16]。其中气相色谱-质谱法应用较为广泛，以选择离子监测模式能实现低含量生物碱的测定。

本实验采用单通道吸烟机-ELPI分12级捕集卷烟主流烟气的气溶胶粒相物，通过气相色谱-质谱法测定7种主要生物碱在不同粒径烟气气溶胶中的分布，研究了烟气气溶胶粒相物中7种生物碱含量和浓度与气溶胶粒相物粒径的关系。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

JJD200型单通道吸烟机(郑州嘉德机电科技有限公司)；Dekati电子低压撞击器(芬兰Dekati公司);Clarus 600 GC气相色谱仪，配Clarus 600 MS质谱检测器(美国Perkin Elmer公司)；KQ-700 V型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；TG16-WS离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);BT 125 D电子天平(感量0.01 mg，德国Sartorius AG)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)。

烟碱、降烟碱、麦斯明、烟碱烯、新烟碱、2,3′-联吡啶、可替宁、喹啉-d7(标准品，纯度≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；二氯甲烷、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；氢氧化钠、无水硫酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；盐酸(分析纯，北京益利精细化学品有限公司)；根据目前卷烟主流产品规格进行制备的空白卷烟样品(不进行外加香，只加入0.5%丙二醇)。

1.2 标准溶液的制备

分别准确称取上述7种生物碱标准品(精确至0.000 1 g)，以二氯甲烷为溶剂配成烟碱质量浓度为1 000 mg/L，降烟碱、麦斯明、烟碱烯、新烟碱、2,3′-联吡啶、可替宁质量浓度为500 mg/L的混合标准使用溶液。准确称取内标物喹啉-d7，用二氯甲烷配成100 mg/L的标准内标溶液。分别准确移取混合标准使用溶液和内标溶液于不同的容量瓶中，用二氯甲烷配制成烟碱质量浓度为2.0、10.0、40.0、200.0、400.0 mg/L，降烟碱、麦斯明、烟碱烯、新烟碱、2,3′-联吡啶、可替宁质量浓度为0.05、0.25、1.0、5.0、10.0 mg/L的系列混合标准工作溶液，每级标准溶液中内标物喹啉-d7的质量浓度均为5.0 mg/L，相当于每支烟中烟碱的含量为2.0、10.0、40.0、200.0、400.0 μg/cig，降烟碱、麦斯明、烟碱烯、新烟碱、2,3′-联吡啶、可替宁总含量为0.05、0.25、1.0、5.0、10.0 μg/cig。

1.3 气相色谱-质谱分析

色谱柱：DB-5 MS弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.，美国Agilent公司)；进样口温度：250 ℃；载气：He(纯度≥99.999%)，流速1 mL/min；进样量：1 μL；进样方式：分流进样，分流比：5∶1；升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升温至200 ℃，再以20 ℃/min升温至280 ℃，保持8 min。

电离方式：电子源轰击(EI)；离子源温度：200 ℃；传输线温度：280 ℃；溶剂延迟：6.7 min；采用选择离子监测(SIM)方式，检测的特征离子及保留时间见表1。

表1 7种生物碱及其内标的定量、定性离子和保留时间Table 1 Quantitative ions,qualitative ions and retention times of 7 alkaloids and internal standard

1.4 气溶胶分级捕集

参照Wang等[9]报道的方法进行卷烟烟气气溶胶分级捕集。采用单通道吸烟机连续抽吸10支卷烟，每支卷烟抽吸6口，抽吸方式为矩形曲线，抽吸容量为35 mL，抽吸时间2 s，抽吸周期60 s。卷烟抽吸产生的烟气经压缩空气稀释后进入电子低压撞击器(ELPI)测试系统，不同粒径的烟气粒相物分12级捕集于聚酯薄膜上。整个实验环境温度控制为(22±0.5) ℃，相对湿度控制为(60±3)%。

1.5 不同粒径气溶胶中生物碱的测定

将捕集后的聚酯薄膜分别按照级别1～3、4、5、6、7、8、9～12合并后置于不同的50 mL锥形瓶中。

(1)加碱提取法：分别准确加入10 mL二氯甲烷、2.5 mL 5%的氢氧化钠溶液、0.1 mL质量浓度为500 mg/L的喹啉-d7内标溶液，密闭后放入超声波水浴中常温下提取15 min。提取完成后，将提取液全部转移至离心试管中，并以6 000 r/min离心5 min。吸取下层清液经无水硫酸钠除水，过0.22 μm有机微孔滤膜后，进行GC-MS分析。若目标分析物浓度超过标准曲线范围，则适当稀释后测定。

(2)有机溶剂提取法：分别准确加入10 mL甲醇、0.1 mL质量浓度为500 mg/L的喹啉-d7内标溶液，密闭后放入超声波水浴中常温下提取15 min，提取液经无水硫酸钠除水，过0.22 μm有机微孔滤膜后，进行GC-MS分析。

(3)加酸-碱提取法：分别准确加入10.0 mL浓度为1.0 mol/L的盐酸溶液，超声提取15 min，提取液用5.0 mL二氯甲烷萃取2次，弃去二氯甲烷萃取液，然后调节剩余的水相pH值至13.0，加入0.1 mL质量浓度为500 mg/L的喹啉-d7内标溶液，用5 mL二氯甲烷萃取2次，吸取萃取液经无水硫酸钠除水，过0.22 μm有机微孔滤膜后，进行GC-MS分析。

图1 不同方法对气溶胶中7种生物碱提取效率的影响(n=3)Fig.1 Influence of different methods on extraction yields of 7 alkaloids from aerosol particles(n=3)method 1：organic solvent extraction method(有机溶剂提取法)； method 2：alkali extraction method(加碱提取法)；method 3：acid-alkali extraction method(加酸-碱提取法)

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

烟草生物碱通常与有机酸或无机酸结合以盐的形式存在，采用有机溶剂提取法[17]、加酸-碱提取法[18]、加碱提取法[16]进行提取。采用有机溶剂直接提取，操作简便，但提取出的杂质较多；采用加碱提取法，结合态生物碱在强碱性条件下转化为游离态，可提高生物碱的提取率，且方法简便，提取出的水溶性杂质少；采用加酸-碱提取法，先用酸提取使生物碱与酸成盐后易溶于水，采用有机溶剂萃取可去除一些中性和酸性成分，再加碱使生物碱游离出，该法净化效果较好，但操作繁琐，多步操作可能造成目标物损失[16]。由于以上3种方法各具优缺点，实验比较了3种提取方法对卷烟烟气气溶胶中7种生物碱的提取效果，结果见图1。由图1可见，采用加碱提取法通过碱液与结合态生物碱作用使生物碱游离出，明显提高了生物碱的提取率。采用醇类有机溶剂进行提取，降烟碱和新烟碱的提取率明显低于加碱提取法，可能是因为有机溶液能提取出游离生物碱，而对结合态生物碱的提取量较低。采用酸-碱提取法，部分生物碱(包括烟碱、麦斯明、烟碱烯、新烟碱、2,3′-联吡啶)的提取率低于加碱提取法(41%～59%)，可能是因为多步萃取和反萃取操作中造成了生物碱的损失。采用加碱提取法时7种生物碱均获得较高的提取率，操作简便，且后续气相色谱-质谱检测时目标物色谱峰未见干扰，因此本实验选择加碱提取法提取卷烟气溶胶中的生物碱。

2.2 分析条件的优化

采用较高的初始温度进行色谱分离，并优化了程序升温条件，在较短的分析时间内实现了目标物的分离。对于质谱条件，以目标物响应高、干扰少的碎片离子作为定量离子，参数列于表1。在优化的测定条件下，标准溶液和卷烟气溶胶样品的色谱分离图见图2，分析物峰形良好，所需分析时间短。

2.3 方法评价

取系列混合标准溶液按优化的色谱条件进行测定，以各目标分析物定量离子与内标物喹啉-d7定量离子的响应值比值为纵坐标，各目标分析物定量离子与内标物喹啉-d7的浓度比值为横坐标，绘制标准曲线。根据保留时间定性，采用内标法定量。将空白样品按照加碱提取法进行前处理后测定10次，以空白响应的3倍标准偏差作检出限(LODs)，10倍标准偏差作定量下限(LOQs)。将捕集的气溶胶样品按照加碱提取法处理后测定，以7次平行样测定的峰面积计算相对标准偏差。取空白样品，添加烟碱含量为4.0、20.0、100.0 μg/cig，降烟碱、麦斯明、烟碱烯、新烟碱、2,3′-联吡啶、可替宁含量均为0.2、1.0、5.0 μg/cig 的3个水平标准溶液进行回收率测定，结果见表2。

结果表明，7种生物碱在测定的浓度范围内线性关系良好，方法检出限(LOD)为0.39～14.84 ng/cig，相对标准偏差(RSD)不大于6.4%，回收率为85.5%～124.8%，表明该方法定量准确，能够满足烟气气溶胶中生物碱的定量分析要求。

表2 方法的相关系数、检出限、定量下限、精密度与回收率Table 2 Correlation coefficients,detection limits,quantitation limits,precisions and recoveries of the method

2.4 实际样品中生物碱含量的测定与粒径分布研究

表3 捕集的粒径级别和气溶胶粒相物质量Table 3 Stage of particle size and particle mass(PM) of collected smoke aerosol

实验卷烟样品按照“1.4”条件进行抽吸，分12级捕集于聚酯薄膜上，捕集的粒径和各级捕集到的气溶胶粒相物质量见表3。从表3中可以看出，实验卷烟样品的气溶胶质量主要分布在0.144～0.722 μm，小于0.07 μm和大于1.166 μm的粒相物较少，质量中位直径均在0.431 μm附近，与文献报道结果相一致[19]。

由于捕集级别1～3和9～12级捕集到的气溶胶粒相物质量较少，在进行生物碱含量测定时，将1～3级、9～12级捕集的气溶胶粒相物合并后进行测定，结果见图3。图3显示了不同粒径气溶胶中检测到的各生物碱的含量，结果显示捕集的气溶胶中烟碱含量最高，其他6种生物碱含量较低，与文献报道一致[20]。7种生物碱主要集中分布在中等粒径的粒相物中(0.144～0.722 μm)，在粒径0.431 μm的粒相物中含量最高，与捕集的粒相物质量分布基本一致，小于0.07 μm或大于1.166 μm的粒相物中则分布更少或者未检出。

图3进一步比较了7种生物碱在不同粒径粒相物中的浓度(不同粒径中各生物碱质量与捕集的粒相物质量之比，以百分比表示)分布，结果显示7种生物碱在不同粒径气溶胶中的浓度基本趋于一致，表明7种生物碱浓度随气溶胶的粒径分布无特异性，该结论与Wang等[9]测定的烟碱随气溶胶的粒径分布规律相一致。

3 结 论

采用电子低压撞击器(ELPI)分12级捕集卷烟烟气气溶胶粒相物，并建立了烟气气溶胶中7种生物碱测定的气相色谱-质谱法(GC-MS)。捕集的气溶胶样品采用碱法提取，提取液经DB-5MS弹性毛细管柱分离，选择离子监测模式测定，内标法定量。该方法测定7种生物碱的相对标准偏差(RSD)不大于6.4%，LOD为0.39～14.84 ng/cig，回收率为85.5～124.8%，方法前处理简单，准确性高。采用建立的方法研究了7种生物碱在不同粒径卷烟主流烟气气溶胶中的分布，发现7种生物碱主要集中分布在中等粒径的粒相物中(0.144～0.722 μm)，在粒径0.431 μm的粒相物中含量最高，与捕集的粒相物质量分布基本一致；7种生物碱在不同粒径气溶胶中的浓度基本趋于一致，浓度随气溶胶粒径的分布无特异性。本文的研究结果可为评价卷烟烟气中生物碱对人体的作用以及卷烟设计提供支持。

图3 7种生物碱在气溶胶粒相物上的分布(n=3)Fig.3 Distribution of 7 alkaloids with respect to aerosol particle size(n=3)A.nicotine;B.nornicotine;C.myosmine;D.nicotyrine;E.anabasine;F.2,3′-bipyridyl;G.cotinine

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Distribution of 7 Alkaloids in Aerosol of Various Particle Sizes from Mainstream Cigarette Smoke

ZHU Qin1,2,LIU Zhi-hua2,ZHU Rui-zhi2,YANG Guo-rong2,ZHANG Feng-mei2,ZHANG Jian-rong2,WANG Ya-ming1*,SI Xiao-xi2*

(1.Faculty of Chemical Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.R&D Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.,LTD,Key Laboratory of Tobacco Chemistry,Kunming 650231,China)

A method was developed for the analysis of 7 alkaloids in mainstream cigarette smoke aerosol by gas chromatography-mass spectrometry.By using electrical low-pressure impactor(ELPI),particles of cigarette smoke aerosol were divided into 12 stages and collected.The content and concentration distributions of 7 alkaloids with respect to smoke aerosol particle size were investigated.The collected aerosol particles were treated by alkali extraction method with sodium hydroxide solution and dichloromethane.The extract was separated with a DB-5MS capillary column under selected ion monitoring(SIM) mode.The targets were quantitatively analyzed using internal standard method.The results showed that,the relative standard deviations(RSDs) for the established method ranged from 2.1%to 6.4%,with limits of detection(LODs) of 0.39-14.84 ng/cig,and the recoveries at three spiked levels ranged from 85.5%to 124.8%.All of 7 alkaloids mainly distributed in aerosol of medium size particles(0.144-0.722 μm) with a peak content at particle size of 0.431 μm,which was similar to the distribution pattern of collected particle mass.The concentrations of 7 alkaloids were uniform throughout the particles of various sizes,indicating a non-specificity distribution.

mainstream smoke;aerosol;alkaloids;size distribution;gas chromatography-mass spectrometry

2017-06-01；

2017-07-25

云南中烟工业有限责任公司科技开发项目资助(2016JC04)

*

王亚明，博士，教授，研究方向：新型催化剂在天然产物深加工中的应用，Tel：0871-65920196，E-mail:wym@Kmust.edu.cn 司晓喜，硕士，工程师，研究方向：烟草化学、烟气化学，Tel：0871-65869684，E-mail:sixiaoxi2006@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.015

O657.63；TS41

A

1004-4957(2017)11-1380-07