生姜青枯病防治药剂室内筛选及评价

朱志刚, 胡洪涛*, 石丽桥, 曹春霞, 姚经武, 黄大野, 龙 同, 邱正明, 陈 伟, 杨自文*

(1. 湖北省生物农药工程研究中心, 武汉 430064; 2. 湖北省农业科学院经济作物研究所, 武汉 430064)

生姜青枯病防治药剂室内筛选及评价

朱志刚1, 胡洪涛1*, 石丽桥1, 曹春霞1, 姚经武1, 黄大野1, 龙 同1, 邱正明2, 陈 伟1, 杨自文1*

(1. 湖北省生物农药工程研究中心, 武汉 430064; 2. 湖北省农业科学院经济作物研究所, 武汉 430064)

采用比浊法测定了10种药剂对生姜青枯菌的毒力,结果显示乳酸环丙沙星、盐酸环丙沙星、土霉素的毒力最强,其EC50分别为1.75、1.81和2.21 μg/L;而硫酸庆大霉素、硫酸链霉素、头孢曲松钠、中生菌素次之,EC50分别为11.17、11.23、19.23和24.20 μg/L;姜瘟净、硫酸多黏菌素B和大蒜油的EC50最高,分别为549.61,1 223.22和2 064.33 μg/L。通过盆栽试验,采用药剂浸种、先灌药后接种病原、以及先接种病原后灌药等处理方式评价了这10种药剂对生姜青枯病预防和治疗的潜能,结果显示,硫酸链霉素和中生菌素浸种处理对生姜青枯病防效最好,分别为93.0%和75.9%;硫酸链霉素、硫酸多黏菌素B、姜瘟净、大蒜油表现出较好的预防作用;除硫酸链霉素外,其他药剂对青枯病治疗作用差。

生姜; 姜瘟病; 青枯菌; 药剂筛选; 硫酸链霉素; 大蒜油; 中生菌素

青枯病是世界性重要土传病害之一,病原为青枯雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum,简称青枯菌。该菌通常从根部侵染,然后在维管束大量繁殖、并沿维管束向上传播,同时分泌多糖等物质,导致维管束堵塞，植株萎蔫死亡。青枯菌可侵染54科450多种植物[1],但以生姜、番茄、马铃薯等受害最为严重。生姜在我国种植历史悠久,其根状茎兼具食用和药用价值,是老百姓餐桌上重要的调味料,而生姜青枯病在我国河南、山东、安徽、四川、云南、广西、海南等地区的生姜产区均有发生[2-7],因其发病快、致死率高、无有效防治手段,经常给生姜生产带来巨大的经济损失,因而俗称姜瘟病[2]。通常情况下,病原首先侵染生姜地下肉质茎,致使内部组织逐渐软化、腐烂,最后仅剩表皮,而叶表现为黄化褪绿,边缘卷曲、萎蔫,重病田发病率高达70%以上[3]。

生姜青枯病传播途径较为复杂[3],主要通过带菌土壤传播,此外还可通过雨水、农事操作、土壤中残存的病残体等进行扩散。再者,大约2%的留种生姜也带菌,在次年分种切割时,也可通过刀具传播。因此,相对而言,生姜青枯病防治难度更大,需要考虑种姜处理和田间防治。青枯病的防治研究已开展多年,防治技术和手段种类较多[8],以化学药剂,如氯化苦等,进行土壤熏蒸消毒效果最佳[9],但由于熏蒸操作技术复杂、成本高,尚未大规模应用。目前,研究较多的是生物防治,通过田间喷施有益拮抗菌抑制病原菌生长并诱导植株产生抗病性[10-11],但由于防效不稳定,应用范围受到局限。农业防治,如水旱轮作[12],也可以防治青枯病,但青枯菌在土壤中能存活长达十年之久,短期轮作效果并不理想。实践中,采用最多的是化学药剂灌根处理,其中以硫酸链霉素应用最广,但由于其有毒，存在环境和食品安全隐患,在农业上的应用受到极大限制。因此,生产上迫切需要筛选硫酸链霉素替代药剂、研究生姜青枯病的系统防治技术和措施,保证生姜产业健康可持续发展。

本研究通过比浊法测定了姜瘟净、大蒜油、中生菌素等10种药剂对生姜青枯菌的毒力,同时,通过盆栽试验测定了他们在不同处理条件下预防和治疗青枯病的潜能,明确姜瘟净、大蒜油等生物药剂对生姜青枯病的防治效果,为筛选硫酸链霉素替代药剂、有效防治生姜青枯病奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 生姜青枯菌的制备

生姜青枯菌2016年分离自安徽铜陵生姜青枯病发生田,经测试对生姜致病性强[4]。分离菌株于25%甘油中,-80℃下保存。保存的青枯菌在TTC培养基上活化(28℃),挑取中心粉红色、周围白边的单菌落于SPA液体培养基中,150 r/min、28℃振荡培养48 h,调整菌液浓度至1×109cfu/mL,备用。

1.2 供试药剂

硫酸链霉素、盐酸环丙沙星、乳酸环丙沙星、土霉素、硫酸庆大霉素、硫酸多黏菌素B购置于武汉佰铭通科技有限公司,含量均为98%以上;头孢曲松钠为华北制药生产；中生菌素(含量98%)为福建凯立生物制品有限公司生产；大蒜油(含量80%)和姜瘟净(主要成分为黄芪多糖、小檗碱、紫草素,总含量为2.8%)为潍坊奥丰作物病害防治有限公司生产。

1.3 药剂对青枯菌毒力测定

用分析天平(PL203,梅特勒-托利多仪器有限公司)分别称取0.2～5.0 g药剂,放入装有玻璃珠的消毒具塞三角瓶(250 mL)中,用无菌水标定总重量至100.0 g,放置于摇床上,振荡5 min使之完全溶解,成为母液。然后,根据药剂含量,按照倍比法进行稀释,使稀释液浓度在50 000～0.1 μg/L范围内,分别取1.0 mL稀释药液,加入装有4.0 mL SPA培养基的试管,并加入10 μL青枯菌菌悬液,每个浓度重复3次。以不加药液的培养基为阴性对照,以不加药但加青枯菌为阳性对照。所有试管均放置于摇床上振荡培养(28℃,150 r/min),待阳性对照吸光度值(OD600)为1.2左右时取出,用分光度计(752N,上海精密科学仪器有限公司)测量各药剂处理吸光度值,计算其抑菌效果。所得数据输入IBM SPSS Statistics软件,计算EC50。

抑菌效果(%)=

1.4 药剂浸种处理对青枯病的防效

健康生姜根状茎(市购)经25℃催芽处理,待新芽长出2～4 mm,用消毒手术刀,将其按新芽分成小块,每块保留1～2个新芽,在药液(药液浓度根据前期预备性试验结果,选取各药剂防效最好的浓度作为测试浓度,数据没有在本文显示)中浸泡30 min,捞出,在阴凉通风处晾干后播入穴盘(21孔),每穴1块根状茎,新芽朝上并露出营养基质表面。每处理10块根状茎,重复3次,采用无菌水处理作为阴性对照。处理后的穴盘放置于人工温室,在(28±2)℃,L∥D=12 h∥12 h下培养。待药剂处理24 h后,将浓度为1×109cfu/mL的青枯菌灌入穴盘,每穴20 mL。接种青枯菌后,每24 h观测1次,待阳性对照发病率在90%上时,记录各处理发病株数,计算校正防效,公式如下:

校正防效(%)=

1.5 药剂灌根处理对青枯病预防效果

将供试药剂稀释一定倍数(药液浓度根据前期预备性试验结果,选取各药剂防效最好的浓度作为测试浓度,数据没有在本文显示),灌入2～4叶期健康盆栽生姜苗根部,每株20 mL,每处理10株苗,重复3次。将处理后的生姜苗置于人工温室,在(28±2)℃,L∥D=12 h∥12 h条件下培养。待药剂处理24 h后,用消毒针在茎基部周边刺3个微孔,然后将浓度为1×109cfu/mL 青枯菌沿茎基部灌入,每株25 mL。接种青枯菌后,每24 h观测1次,待对照发病率在90%上时,记录各处理发病株数,按照1.4公式计算校正防效。

1.6 药剂灌根处理对青枯病治疗效果

选用2～4叶期健康盆栽生姜苗,用消毒针在其茎基部刺3个微孔,然后将浓度为1×109cfu/mL青枯菌沿茎基部灌入,每株25 mL。将处理后的生姜苗置于人工温室,在(28±2)℃,L∥D=12 h∥12 h条件下培养。接种青枯菌24 h后,分别灌入20 mL所测定药剂稀释液(浓度见表3),每处理10株生姜苗,重复3次。处理后,每24 h观测1次,待对照发病率在90%上时,记录各处理发病株数,按照1.4公式计算校正防效。

1.7 方差分析

所得数据输入Excel 2016计算校正防效,然后,使用IBM SPSS Statistics软件采用Duncan’s方法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 药剂对生姜青枯菌的毒力测定

采用比浊法,测试了10种药剂对生姜青枯菌的毒力,结果表明,乳酸环丙沙星、盐酸环丙沙星和土霉素的EC50分别为1.75、1.81和2.21 μg/L(表1),显示这3种药剂对生姜青枯菌的毒力最强;硫酸庆大霉素、硫酸链霉素、头孢曲松钠、中生菌素的毒力次之,EC50分别为11.17、11.23、19.23、24.20 μg/L;姜瘟净、硫酸多黏菌素B、大蒜油毒力最差,其EC50分别为549.61、1 223.22、2 064.33 μg/L。

表110种药剂对生姜青枯菌的毒力测定

Table1Toxicityassayof10differentbactericidestoRalstoniasolanacearumonginger

药剂Bactericide半最大效应浓度/μg·L-1EC50线性回归方程Linearregressionequation决定系数(R2)Coefficientofdetermination95%置信区间/μg·L-195%Confidencelimits乳酸环丙沙星Ciprofloxacinlactate1．75y=0．2688x-0．25850．90761．44～2．13盐酸环丙沙星Ciprofloxacinhydrochloride1．81y=0．3129x-0．09610．91190．74～3．47土霉素Oxytetracycline2．21y=0．3107x-0．39000．91651．78～2．75硫酸庆大霉素Gentamycinsulfate11．17y=0．2005x+0．51360．89779．27～13．59硫酸链霉素Streptomycin11．23y=0．2091x-0．18770．92348．80～14．30头孢曲松钠Ceftriaxonesodium19．23y=0．2005x+0．51360．899714．17～27．10中生菌素Zhongshengmycin24．20y=0．1792x-0．11980．991019．54～30．23姜瘟净Jiangwenjing549．61y=0．1853x+0．60270．9620420．49～1177．62硫酸多黏菌素BPolymyxinBsulfate1223．22y=0．2759x-0．10230．9551993．64～1859．96大蒜油Garlicoil2064．33y=0．2171x+0．15780．94571739．49～2504．10

2.2 药剂浸种处理对青枯病的防效

通过药剂浸种评价了10种药剂对生姜青枯病的预防能力,在接种青枯菌32 d后,阳性对照死苗率为90%～100%。硫酸链霉素和中生菌素对青枯菌预防效果最好,校正防效分别为93.0%和75.9%,但两者无显著性差异(P>0.05);硫酸多黏菌素B、头孢曲松钠、土霉素、硫酸庆大霉素、姜瘟净等对青枯菌的预防能力次之,校正防效在20.7%～45.2%之间;乳酸环丙沙星、盐酸环丙沙星和大蒜油预防能力最差,校正防效在10.4%～17.4%之间(表2)。

表210种药剂浸种处理对青枯病的防效1)

Table2Controlefficaciesof10differentbactericidesongingerbacterialwiltbyrhizomesoaking

药剂Bactericide浓度/μg·L-1Concentration校正防效/% Controlefficacy平均值±标准误 Average±SE显著性分析 Statisticalanalysis硫酸链霉素Streptomycin1000．093．0±3．53a中生菌素Zhongshengmycin3333．375．9±3．03a硫酸多黏菌素BPolymyxinBsulfate3333．345．2±7．76b头孢曲松钠Ceftriaxonesodium1000．031．5±7．09b土霉素Oxytetracycline1000．024．4±4．44b硫酸庆大霉素Gentamycinsulfate1000．024．4±4．44b姜瘟净Jiangwenjing93．320．7±5．82b乳酸环丙沙星Ciprofloxacinlactate1000．017．4±3．76c盐酸环丙沙星Ciprofloxacinhydrochloride1000．013．7±8．76c大蒜油Garlicoil2666．710．4±5．79c

1) 表中同列字母相同者代表在0.05水平无显著性差异。下同。

The letters in the same column represent no significant difference at the 0.05 level. The same below.

2.3 药剂灌根处理对青枯病的预防效果

通过在接种前24 h使用药剂浇灌2～4叶期生姜苗根部评价10种药剂预防生姜青枯病的能力,结果见表3。接种青枯菌7 d后,以硫酸链霉素防效最好,为56.7%,姜瘟净、硫酸多黏菌素B、土霉素防效次之,分别为53.3%、50%和40%,但这4种药剂防效在统计学上无显著差异(P>0.05);大蒜油防效为36.7%,与姜瘟净、硫酸多黏菌素B、土霉素防效无显著差异(P>0.05);中生菌素、硫酸庆大霉素防效分别为30%、23.3%,二者无显著性差异(P>0.05)。乳酸环丙沙星、头孢曲松钠、盐酸环丙沙星防效最差,分别为13.3%、10%和6.7%。接种10 d后,各药剂防效均下降,以硫酸链霉素处理防效最好,为56.7%,显著高于其他药剂(P<0.05)。姜瘟净、硫酸多黏菌素B、大蒜油防效分别为40%、36.7%、33.3%,它们的防效处于同一水平(P>0.05)。而土霉素、中生菌素、硫酸庆大霉素、盐酸环丙沙星、乳酸环丙沙星防效最差,在10%～23.3%之间。接种13 d后,各药剂防效继续下降,仍以硫酸链霉素处理防效最好,为46.7%,显著高于其他药剂(P<0.05)。姜瘟净、硫酸多黏菌素B防效次之,分别为33.3%、26.7%,它们防效处于同一水平(P>0.05)。而大蒜油、土霉素等药剂防效均低于15%。

表310种药剂对生姜青枯病预防效果

Table3Preventionefficaciesof10differentbactericidesongingerbacterialwilt

药剂Bactericide浓度/μg·L-1Concentration校正防效/% Controlefficacy接种后7d7dafterinoculation接种后10d10dafterinoculation接种后13d13dafterinoculation土霉素Oxytetracycline1000．0(40．0±5．77)abc(23．3±6．67)cd(13．3±6．67)c硫酸链霉素Streptomycin1000．0(56．7±3．33)a(56．7±3．33)a(46．7±3．33)a盐酸环丙沙星Ciprofloxacinhydrochloride1000．0(6．7±3．33)d(13．3±3．33)d(6．7±3．33)c乳酸环丙沙星Ciprofloxacinlactate1000．0(13．3±8．82)d (10．0±5．77)d (6．7±3．33)c头孢曲松钠Ceftriaxonesodium1000．0(10．0±5．77)d (13．3±6．67)d (10．0±0．00)c硫酸庆大霉素Gentamycinsulfate1000．0(23．3±3．33)cd(16．7±3．33)d(6．7±3．33)c中生菌素Zhongshengmycin3333．3(30．0±5．77)c(20．0±0．00)cd(13．3±6．67)c硫酸多黏菌素BPolymyxinBsulfate3333．3(50．0±5．77)ab(36．7±3．33)b(26．7±3．33)b姜瘟净Jiangwenjing93．3(53．3±3．33)ab(40．0±5．77)b(33．3±3．33)b大蒜油Garlicoil2666．7(36．7±3．33)bc(33．3±3．33)bc(13．3±3．33)c

2.4 药剂灌根对青枯病治疗效果

通过预先接种青枯菌,24 h后用药剂灌根,评价药剂对青枯病的治疗效果,结果见表4。接种青枯菌5 d后,以硫酸链霉素防效最好,为36.7%,显著高于其他药剂(P<0.05)。硫酸多黏菌素B、中生菌素、姜瘟净、土霉素、硫酸庆大霉素、盐酸环丙沙星、乳酸环丙沙星、大蒜油的防效分别为16.7%、13.3%、13.3%、10.0%、10.0%、10.0%、6.7%、6.7%,这6种药剂防效在统计学上无显著性差异(P>0.05)。头孢他啶防效最差,仅为3.3%。接种青枯菌7 d后,各药剂防效明显下降,但仍以硫酸链霉素防效最好(36.7%),显著高于其他药剂(P<0.05)。

表410种药剂对青枯病的治疗效果

Table4Curingefficaciesof10differentbactericidesongingerbacterialwilt

药剂Bactericide浓度/μg·L-1Concentration校正防效/% Controlefficacy接种后5d 5dafterinoculation接种后7d 7dafterinoculation土霉素Oxytetracycline1000．010．0bc6．7b硫酸链霉素Streptomycin1000．036．7a26．7a盐酸环丙沙星Ciprofloxacinhydrochloride1000．010．0bc3．3b乳酸环丙沙星Ciprofloxacinlactate1000．06．7bc0．0b头孢曲松钠Ceftriaxonesodium1000．03．3c0．0b硫酸庆大霉素Gentamycinsulfate1000．010．0bc6．7b中生菌素Zhongshengmycin3333．013．3bc3．3b硫酸多黏菌素BPolymyxinBsulfate3333．016．7bc6．7b姜瘟净Jiangwenjing93．313．3bc3．3b大蒜油Garlicoil2666．76．7bc3．3b

3 讨论

生姜作为特色经济作物在我国有着悠久的种植历史，部分品种，如‘铜陵白姜’，由于营养丰富、品质优良，曾列为朝廷贡品[13]。近年来，由于市场需求上升，而产量增加有限，导致供需失衡、价格居高不下。生姜青枯病在生姜种植区普遍发生，成为生姜生产最主要限制因子。尽管针对青枯病，包括番茄青枯病、烟草青枯病等，已开展了大量室内药剂筛选和田间评价工作[5,9-12,14]，但由于生姜青枯病传播途径特殊，对其防治方法和技术措施尚缺乏系统研究。本研究针对生姜青枯病的发生和传播特点，采用药剂浸种、灌根后接种青枯菌以及接种后再灌根的方法评价了具有防治青枯病潜能的10种药剂，旨在为解决生姜青枯病的防治难题提供理论指导和防治依据。

测试发现,10种药剂中乳酸环丙沙星、盐酸环丙沙星、土霉素等对生姜青枯菌具有较强的毒力,但这几种药剂无论是采用浸种还是灌根处理,对青枯病防效均不理想,这可能是由于青枯病属于维管束病害,药剂的防效与药剂内吸性有关。硫酸链霉素和中生菌素对生姜青枯菌的EC50也较低,说明安徽来源的生姜青枯菌对其敏感,但其值高于番茄或茄子青枯的EC50[5,14],提示安徽铜陵生姜青枯菌可能对这两种药剂存在抗药性。

供试的10种药剂中，硫酸链霉素无论是通过浸种还是灌根，其预防或治疗青枯病的效果均为最好，其中以浸种效果最好，接种后32 d，防效仍高达93.0%。浸种效果较好的还有中生菌素，防效为75.9%，而且其防效明显高于采用灌根进行预防或治疗的效果，显示这两种药剂浸种处理可以有效防治生姜青枯病。其他种药剂浸种处理对生姜青枯病的防效较差，提示它们不适合作为浸种剂应用。

前人研究表明，带菌土壤是青枯病的主要病源，预防青枯菌的侵入是防治青枯病的关键[6,8]。本文采用灌根后接种病原菌的方法评价了供试的10种药剂对生姜青枯病的预防能力，结果表明接种青枯菌后7 d，硫酸链霉素、姜瘟净、硫酸多粘菌素B的防效在50%以上，但它们的防效随着时间推移显著下降，至13 d时，仅硫酸链霉素防效为46.7%，其余药剂防效均低于40%，显示硫酸链霉素对生姜青枯病的残效期最长，同时也提示，预防青枯病的防治周期应该小于7 d。生物药剂姜瘟净、硫酸多粘菌素B、大蒜油在接种后7 d内对生姜青枯病具有一定防效，提示这3种药剂可部分替代硫酸链霉素使用，但防治周期应该相应缩短。

此外，我们还通过接种青枯菌24 h后再灌根的方法评价了供试的10种药剂对生姜青枯病的治疗作用。结果表明，接种青枯菌后5 d，除硫酸链霉素外，其他药剂防效均低于20%，而接种后7 d，除硫酸链霉素外，其他药剂的防效均低于10%，提示这些药剂对青枯病的治疗效果差，或者基本无效。因此，对于已发病的生姜植株，为减少经济损失，不建议进行药剂防治，而应该及时拔除，同时对植株周边土壤进行消毒，防治病原进一步扩散。

综合本研究结果，硫酸链霉素为防治生姜青枯病的首选药剂，可用于浸种、灌根预防或者治疗青枯病。然而，2011年6月22日，农业部办公厅印发《第八届全国农药登记评审委员会第九次全体会议纪要》的通知，停止受理和批准硫酸链霉素的新增田间试验、农药登记，已批准含有硫酸链霉素的产品,其登记证件到期后不再办理续展登记。因此，硫酸链霉素将很快被停止作为农药使用，寻找硫酸链霉素替代药剂已迫在眉睫，姜瘟净、中生菌素、硫酸多粘菌素B以及大蒜油对生姜青枯病具有一定的预防作用，提示这些药剂可以单用或混合使用来替代硫酸链霉素，但由于其防治效果较硫酸链霉素差，在实践中应用时，应结合实际情况，调整用药浓度和用药周期。

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(责任编辑： 杨明丽)

Indoorsscreeningandevaluationofbactericidescontrollinggingerbacterialwilt

Zhu Zhigang1, Hu Hongtao1, Shi Liqiao1, Cao Chunxia1, Yao Jingwu1, Huang Daye1, Long Tong1, Qiu Zhengming2, Chen Wei1, Yang Ziwen1

(1.HubeiBiopesticideEngineeringResearchCenter,Wuhan430064,China; 2.InstituteofEconomicCrops,HubeiAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan430064,China)

Toxicity of 10 different bactericides onRalstoniasolanacearum, the causal agent of ginger bacterial wilt, was measured by turbidimetry method. The results showed that the toxicity of ciprofloxacin lactate, ciprofloxacin hydrochloride and oxytetracycline were the strongest with the EC50values of 1.75, 1.81 and 2.21 μg/L, respectively, followed by gentamycin sulfate, streptomycin, ceftriaxone sodium and zhongshengmycin, with the EC50values of 11.17,11.23, 19.23 and 24.20 μg/L, respectively. Jiangwenjing, polymyxin B sulfate, and garlic oil had the highest EC50value of 549.61,1 223.22 and 2 064.33 μg/L, respectively. Meantime, the preventing and curing potentials of these 10 bactericides against ginger bacterial wilt were evaluated through pot experiments in 3 different ways, including rhizome soaking with chemicals, root drenching with chemicals followed by pathogen inoculation and pathogen inoculation followed by root drenching. The results showed that the control effects of rhizome soaking with streptomycin and zhongshengmycin were the best, with the control effects of 93.0% and 75.9%, respectively. Streptomycin, polymyxin B sulfate, Jiangwenjing, garlic oil exhibited better prevention effects. Except streptomycin, others showed worse curing effects to ginger bacterial wilt.

ginger; bacterial wilt;Ralstoniasolanacearum; pesticide screening; streptomycin; garlic oil; zhongshengmycin

2017-02-10

2017-03-22

湖北省蔬菜病虫害生物防治技术集成与产品创制(2016ABA103);湖北省农业创新团队项目(2016-620-000-001-039)；湖北省农业科学院基金(2016NKYJJ31)

* 通信作者 E-mail:hzh0005@qq.com; 18627186188@126.com

S 432.4

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10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.036