凉膈散干预治疗对急性胰腺炎患者血清相关miRNAs水平的影响*

郑 峰 陈 波 汪易岚 叶宏伟

（江苏省常熟市第一人民医院，江苏 常熟 215500）

凉膈散干预治疗对急性胰腺炎患者血清相关miRNAs水平的影响*

郑 峰 陈 波 汪易岚 叶宏伟△

（江苏省常熟市第一人民医院，江苏 常熟 215500）

目的观察中医药经典汤剂凉膈散干预治疗对急性胰腺炎患者血清相关miRNAs水平的影响并探讨其机制。方法连续性收录2014年1月至2016年12月本院重症医学科收治的中重症/重症急性胰腺炎（MSAP/SAP）患者共46例，随机数字表法分为凉膈散组和对照组。两组患者分别于入组前和治疗后第10日检测miR-216和miR-92水平，并进行APACHEⅡ评分和Ranson评分，评估病情危重程度。结果在治疗后第10日，两组患者血清miR-216和miR-92均明显下降（P<0.05），凉膈散组患者miR-216和miR-92均明显低于对照组（P<0.05）。治疗后凉膈散组患者APACHEⅡ评分明显下降（P<0.05）。凉膈散组患者APACHEⅡ评分和Ranson评分均明显低于对照组（P<0.05）。凉膈散干预治疗与miR-216和miR-92呈正相关。结论凉膈散干预治疗可以明显降低MSAP/SAP血清AP相关miR-216和miR-92浓度，改善患者临床预后。

急性胰腺炎 凉膈散 微小RNA-216 微小RNA-92

随着我国经济的飞速发展，人民群众生活水平和方式逐步改变，急性胰腺炎（AP）的发病率逐年提高［1］。根据严重程度不同，AP可以分为轻症，中重症（MSAP）和重症（SAP）。MSAP和SAP主要的区别为器官功能衰竭持续时间和严重程度的不同，后两者是内科常见急危重症，治疗方案类似，均具有发病急剧，病情复杂，并发症高以及预后差等特点［2］。荟萃分析证实早期MSAP/SAP更适合内科保守治疗，包括液体复苏、器官功能维持、抗感染、营养支持以及中药治疗［3］。凉膈散是我国经典的传统中药汤剂，出自 《太平惠民和剂局方》，具有泻火解毒，清上泄下功用，主治上中焦邪郁生热证。研究发现凉膈散可以有效抑制脓毒症小鼠体内血小板的活化，同时下调多种炎症因子，具有明显的抗炎和改善凝血功能作用［4］。本课题组前期发现在常规内科治疗的基础上，加用凉膈散可明显缩短MSAP/SAP患者病程及治疗费用，同时减少并发症的发生，但是其中的机理尚未深入研究。微小RNA（miRNA）是一组内源性高度保守非编码单链RNA，由20～22个核糖核苷酸组成，调控上游基因表达和下游蛋白翻译过程，参与体内多种病理和生理反应［5］。目前已有部分研究发现了数个AP相关miRNAs［6］，而关于凉膈散对于这些miRNAs水平影响的报道极少。本研究选择miR-216和miR-92两个已报道的AP相关miRNA作为切入点［6］，综合分析46例MSAP/SAP患者经凉膈散治疗后上述两种miRNA的改变情况。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择 纳入标准：符合2013年美国胃肠病学会急性胰腺炎治疗指南中重度/重症胰腺炎（MSAP/SAP）的诊断标准［7］；年龄 18～80 岁；签署知情同意书。排除标准：伴有胃肠穿孔、肠梗阻、化脓性胆囊炎等及其他原因无法内科保守治疗，必须急诊外科手术患者；妊娠或哺乳期妇女；入组后3 d内死亡，或治疗期间放弃治疗或转院造成临床数据不全者；严重休克，需大剂量血管活性药物患者；持续意识障碍患者；无法完成鼻饲或灌肠治疗的患者。

1.2 临床资料 本研究连续性收录2014年1月至2016年12月本院重症医学科收治的MSAP/SAP患者46例，按照随机数字表法分为凉膈散组和对照组各23例。凉膈散组男性 13 例，女性 10 例；平均年龄（48.2±8.5）岁；BMI（26.9±1.3） kg/m2；吸烟 11 例，饮酒 8 例；心率（110.1±9.1）次/min；平均动脉压（68.4±7.1） mmHg；氧合指数（205.5±22.6）；血清肌酐（243.7±19.8） μmol/L，血清尿素氮（14.6±1.3） μmol/L，血乳酸（3.1±0.3） mmol/L；冠心病2例，高血压5例，糖尿病6例；诱发因素为胆源性11例，暴饮暴食7例，高脂血症3例，其他2例。对照组男性 12 例，女性 11 例；平均年龄（44.6±7.1）岁；BMI（25.8±1.7） kg/m2；吸烟 10 例，饮酒 9 例；心率（108.4±8.9）次/min；平均动脉压（70.1±5.2） mmHg；氧合指数（215.9±17.6）；血清肌酐（231.8±24.5） μmol/L，血清尿素氮（13.3±1.2）μmol/L，血乳酸（2.8±0.2） mmol/L；冠心病3例，高血压4例，糖尿病5例；诱发因素为胆源性13例，暴饮暴食6例，高脂血症2例，其他2例。两组患者资料差异无统计学意义（P>0.05）。

1.3 治疗方法 对照组患者给予常规内科治疗，包括液体复苏、器官功能维持、抗感染、营养支持等，同时维持酸碱及水电解质平衡。治疗组在常规内科治疗的基础上加用凉膈散：连翘15 g，栀子、竹叶、薄荷叶、黄芩各10 g，大黄、玄明粉各9 g，甘草6 g。每日1剂，水煎取汁400 mL，分成200 mL各1份，1份行胃管注入，1份行保留灌肠，每日1次，疗程10d。

1.4 观察项目 1）miRNA检测。两组患者分别于入组前和治疗后第10日留取静脉血15mL左右，用于检测miR-216和miR-92。患者血液样本于4℃3000 r/min条件下离心30 min，留取上清液置于-80℃冰箱中冻存待检。通过Trizol法提取血清总RNA，通过逆转录-聚合酶链反应合成相应miRNA的cDNA，并通过7600型（ABI公司）序列检测系统检测其含量。以U6作为内参，miR-16标准品建立标准曲线，计算血清miRNA的绝对含量。2）所有患者分别于入组时和治疗后第10天进行APACHEⅡ评分和Ranson评分。

1.5 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。正态分布的计量资料以（±s）表示，计量资料比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。通过Pearson和Spearman相关性分析比较凉膈散与不同miRNAs水平变化的相关性比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者AP相关miRNAs水平和临床评分比较见表1。在治疗后第10日，两组患者血清miR-216和miR-92 均明显下降（P＜0.05），凉膈散组患者 miR-216和miR-92均明显低于对照组（P＜0.05）。治疗后凉膈散组患者 APACHEⅡ评分明显下降（P＜0.05）。 凉膈散组患者APACHEⅡ评分和Ranson评分均明显低于对照组（P＜0.05）。

表1 两组患者AP相关miRNAs水平和临床评分比较（±s）

表1 两组患者AP相关miRNAs水平和临床评分比较（±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，△P＜0.05。

组 别 时间m i R-2 1 6（f m o l/L）m i R-9 2（f m o l/L）A P A C H EⅡ评分（分）R a n s o n评分（分）凉膈散组 治疗前（n＝2 3） 治疗后对照组 治疗前8 4 3.1±9 8.4 3 3 3.7±2 8.5 1 9.2±2.5 7.1±0.8 6 6 5.2±9 3.7*△ 2 1 0.8±1 3.5*△ 1 2.4±1.1*△ 5.1±0.5*△9 3 1.8±1 1 2.6 3 6 8.9±2 2.6 1 8.0±2.9 6.8±0.7（n＝2 3） 治疗后7 9 5.4±1 0 2.8* 2 8 4.8±1 6.6* 1 4.3±1.8* 5.8±0.6*

2.2 相关性分析 见表2。以相关系数r>0.6为基准，Pearson和Spearman相关性分析提示凉膈散干预治疗与 miR-216 和 miR-92 水平呈正相关（P<0.05）。

表2 凉膈散、miRNA和临床评分三者相关性分析（相关系数r/P值）

2.3 死亡风险评估 见表3。通过cox回归分析显示MSAP/SAP患者使用凉膈散治疗后，第7日、21日和28日死亡率分别减少2%、4%和10%，而第14日死亡率增加4%，但除了28 d死亡率外，其他均未发现统计学差异（P>0.05）。

3 讨 论

目前的循证医学提示AP患者早期更适合内科保守治疗，包括液体复苏、抗感染、营养支持等，而中医药是内科治疗的重要组成部分。传统中医药汤剂可以明显提高内科治疗疗效，改善临床症状，减少死亡率。本课题组前期发现通过鼻饲和灌肠给药经典方剂凉膈散，可以明显改善患者临床症状，降低炎症指标并减少住院时间。本研究则进一步选择了miR-216和miR-92两种AP相关miRNA作为观察点，结果发现凉膈散干预治疗后可以明显降低血清miR-216和miR-92水平。

表3 凉膈散使用者和非使用者死亡风险比较

miRNA是近十年来的研究热点，是一种内源性的非编码单链小分子RNA，通过与靶点mRNA的3’非翻译区特异性的结合，形成静默复合物抑制靶点mRNA翻译或促进靶点mRNA的降解［8］。在大鼠胰腺和人类胰腺标本中均已证实miR-216在胰腺组织中高特异性表达［9-10］。在AP时胰腺组织损伤坏死，细胞内miR-216大量入血，导致循环中miR-216浓度升高［11］。因此，血清miR-216水平是反映胰腺损伤的生物学标记物。本研究发现凉膈散组和对照组患者治疗10 d后miR-216水平均明显下降，而凉膈散组更加明显。体外实验发现miR-216作为胰腺特异性miRNA，在胰腺受到损伤时可以沉默PTEN和Smad7基因的转录翻译，进而调控PI3k/Akt信号通路，上调转录生长因子β表达，参与AP病理生理学过程。因此，可以猜测凉膈散可能是通过调控miR-216表达，进而改善PI3K/Akt信号通路激活程度，进而改善AP患者临床预后。

miR-92是本研究选择的另一个AP相关miRNA，也是胰腺组织中高特异性表达的miRNA［12］。研究发现miR-92和miR-17之间可以形成群集结构，共同调控胰腺β细胞对于体内糖代谢的反馈和适应，调控胰岛素的合成和释放［13］。本研究发现凉膈散组和对照组患者治疗10 d后miR-92水平均明显下降，而凉膈散组更加明显。动物实验发现，AP时凋亡的胰腺细胞中miR-92水平明显高于正常胰腺细胞，提示miR-92可能参与胰腺细胞凋亡的病理过程。通过过表达和沉默miR-92进一步证实miR-92是AP时胰腺细胞凋亡的重要因子［14］。而凉膈散也可能是通过抑制miR-92的表达进而减少胰腺细胞凋亡，进而改善患者临床症状和预后。

凉膈散作为传统中药经典方剂，主治上中焦邪郁生热证，即为现代医学中的重症胰腺炎等。目前对于凉膈散的临床疗效和药物机理研究甚少，主要是对凉膈散中的单味中药（连翘、黄芩、栀子、大黄和芒硝等）进行研究。有学者通过大鼠SAP模型发现，连翘能显著降低核因子κB的活性及肝脏组织中核因子κB和Foxp3的mRNA表达，从而减轻SAP肝损伤的严重程度［15］。研究证实黄芩对SAP大鼠肝损伤有预防和治疗作用，可以有效减轻肝、胰组织损伤程度［16］。在去氧胆酸造成的SAP大鼠模型中可以观察到栀子苷能提高谷胱甘肽、超氧化物歧化酶的浓度，并且降低丙二醛含量，从而抑制氧化应激反应［17］。大黄和芒硝是研究较多的治疗SAP的中药，临床研究发现大黄和芒硝均可显著改善SAP患者炎症指标和住院时间［18］。中医传统辨证思维强调整体观念，上述研究均为凉膈散中的单味中药研究，缺乏对于凉膈散整体疗效和药理的研究。

综上所述，本课题组在前期工作的基础上，进一步研究发现传统中药汤剂凉膈散干预治疗可以明显降低MSAP/SAP血清AP相关miR-216和miR-92浓度，进而改善患者临床预后，其中的具体机制需要进一步实验研究证实。

［1］余贤恩.急性胰腺炎流行病学及严重性预测评估研究进展［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2015，24（2）：234-237.

［2］Kubiliun NM，Adams MA，Akshintala VS，et al.Evaluation of pharmacologic prevention of pancreatitis following endoscopic retrograde cholangiopancreatography： a systematic review［J］.Clinical Gastroenterology&Hepatology，2015，13（7）：1231.

［3］孙备，苏维宏.急性胰腺炎诊治的现状与进展［J］.临床外科杂志，2015，23（2）：168-170.

［4］张静姝，王勇强，王兵，等.加味凉膈散对脂多糖刺激小鼠血小板活化标志物及炎症因子释放的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2015，23（2）：133-137.

［5］裴颖皓.miRNA在急性心肌梗死诊断中的研究进展［J］.医学综述，2014，20（4）：616-618.

［6］Liu P，Xia L，Zhang WL，et al.Identification of serum microRNAs as diagnostic and prognostic biomarkers for acute pancreatitis［J］.Pancreatology，2014，14（3）：159-166.

［7］钱安瑜，张茂.美国胃肠病学会急性胰腺炎临床处理指南（2013 版）［J］.中华急诊医学杂志，2013，22（12）：1324-1325.

［8］吴金雁，金士毛，王小云，等.急性胰腺炎相关microRNA研究进展［J］.国际消化病杂志，2014，21（6）：386-388.

［9］Endo K，Weng H，Kito N，et al.MiR-216a and miR-216b as markers for acute phased pancreatic injury［J］.Biomedical Research，2013，34（4）：179-188.

［10］傅冬阳，黄元林，陈建洪.miRNA在急性胰腺炎诊断和评估病情严重程度的作用［J］.临床和实验医学杂志，2016，15（14）：1398-1401.

［11］Zhang XX，Deng LH，Chen WW，et al.Circulating microRNA 216 as a marker for the early identification of severe acute pancreatitis［J］.American Journal of the Medical Sciences，2017，29（2）：178-186.

［12］Jun Yu，Ang Li，Seung-Mo Hong，Ralph H.Hruban， Michael Goggins.MicroRNA alterations of pancreatic intraepithelial neoplasms （PanINs）［J］.Clinical Cancer Research，2011，18（4）：981.

［13］Chen Y，Tian L，Wan S，et al.MicroRNA-17-92 cluster regulates pancreatic beta-cell proliferation and adaptation ［J］.Molecular&Cellular Endocrinology，2016，437（C）：213-223.

［14］Yang J，Zeng Y.Identification of miRNA-mRNA crosstalk in pancreatic cancer by integrating transcriptome analysis［J］.European Review for Medical&Pharmacological Sciences，2015，19（5）：825.

［15］范晓彬，李文星，陈炳合，等.连翘对重症急性胰腺炎大鼠肝组织中NF-κB和Foxp3表达的影响［J］.临床肝胆病杂志，2013，29（7）：503-507.

［16］金琦，蔡天蕊，黄朔，等.黄芩对急性重症胰腺炎大鼠肝损伤的预防及治疗作用研究［J］.中国现代医学杂志，2016，26（1）：18-23.

［17］司立洲，卓越.栀子苷对大鼠急性胰腺炎胰腺组织GSH、SOD含量改变的研究［J］.齐齐哈尔医学院学报，2015，29（8）：1101-1102.

［18］芶宇.重用生大黄和芒硝治疗急性胰腺炎的疗效观察［J］.中国中西医结合急救杂志，2016，23（5）：475-478.

Effect of Intervention Treatment of Liangge Decoction on Serum Related miRNAs Levels in Patients with Acute Pancreatitis

ZHENG Feng，CHEN Bo，WANG Yilan，et al. The First people′s Hospital of Changshou City，Jiangsu，Changshu 215500，China.

Objective：To evaluate the effect of Liangge Decoction on serum pancreatitis related miRNA in patients with moderate/severe acute pancreatitis（MSAP/SAP）.Methods：46 patients with MSAP/SAP were enrolled in this study and divided into two groups equally and randomly：LGS group and the control group.The levels of miR-216 and miR-92 were measured on admission day（T0） and ten days after treatment（T1）.APACHE II and Ranson score were used for disease assessment.Results：The contents of miR-216 and miR-92 in both LGS group and the control group were significantly reduced on T1.The levels of miR-216 in LGS group were lower than those in control group on T1 （P<0.05）.The levels of△miR-216（P<0.05） and △miR-92 （P<0.05） in LGS group were higher than those in control group.The levels of APACHEⅡin LGS group were significantly decreased on T1 （P<0.05）.Both △APACHEⅡ（P<0.05）and △Ranson （P<0.05） in LGS group were higher than those in the control group.Correlation analysis showed that Liangge Decoction treatment was positively associated with △miR-216 （r=0.688，P<0.05） and △miR-92 （r=0.613，P<0.05）.Cox regression analysis suggested that Liangge Decoction might reduced the 28 day mortality in MSAP/SAP patients.Conclusion：Liangge Decoction may improve the prognosis of MSAP/SAP patients by reducing serum levels of miR-216 and miR-92 related to serum AP.

Acute pancreatitis；Liangge Decoction；miR-216；miR-92

R576

A

1004-745X（2017）11-2028-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.045

江苏省常熟市科技发展计划（CS201510）；苏州市科教兴卫项目（LCZX201319）

△通信作者（电子邮箱：yehongwei2016@sina.com）

2017-04-26）