银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤大鼠保护作用的研究

2017-11-29孟剑锋

中国中医急症 2017年11期

关键词：内酯造模银杏

孟剑锋

（河北省邢台市人民医院，河北邢台 054031）

银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤大鼠保护作用的研究

孟剑锋

（河北省邢台市人民医院，河北邢台 054031）

目的观察银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用并初步探讨其可能的作用机制。方法采用夹闭左冠状动脉前降支的方法制备大鼠心肌缺血再灌注模型；设假手术组、模型组和银杏内酯B（15、30、60 mg/kg）组，每组20只。监测各组大鼠心电图波动变化；通过高频率超声影像系统检测舒张末期左室内径（LVIDd）和收缩末期左室内径（LVIDs）、短轴缩短率（FS）、射血分数（EF）、每搏输出量（SV）；TTC 染色法检测心肌梗死面积，生化分析法测定血清中心肌酶含量；HE染色法观察心肌组织病理变化；末端标记法（TUNEL）观察细胞凋亡状况。结果与模型组比较，银杏内酯B（15、30、60 mg/kg）组心电图明显改善，以银杏内酯 B 60 mg/kg 组最为显著；银杏内酯 B（30、60 mg/kg）组 LVIDd、LVIDs显著减小（P<0.05），FS 显著提高（P<0.01），EF、SV 显著升高（P<0.01）；心肌组织梗死面积显著降低（P<0.05 或P<0.01），血清心肌酶（AST、CPK、LDH）含量显著降低（P<0.05或P<0.01）；心肌组织病变明显改善，心肌组织凋亡细胞数明显减少、凋亡指数（AI）显著降低（P<0.01）。结论银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

银杏内酯B 心肌缺血再灌注心电图超声凋亡

银杏叶为我国传统中药品种，《本草纲目》和《中药志》中均有记载，其性味甘，苦，涩平，具有益心敛肺、化湿止泻之功效。现代药学研究发现，萜内酯类化合物为银杏叶的主要有效成分，包括银杏内酯A、B、C、M和白果内酯。研究表明银杏内酯为血小板活化因子（PAF）拮抗剂，活性最强的为银杏内酯 B（GB），既往研究发现银杏内酯B具有抗凋亡、抗氧化等多种药理学作用［1-4］。本实验通过建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，通过监测心电图波动、血液流变学、梗死面积、心肌酶含量、组织病变以及细胞凋亡等指标变化，探讨银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验用大鼠品系SD大鼠，清洁级，雄性，鼠龄8周龄，体质量220～260 g，购自河北省实验动物中心，动物许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 药物与试剂银杏内酯B购自美国Sigma公司；TTC购自美国Sigma公司；TUNEL试剂盒购自南京建成生物工程研究所；AST、CPK、LDH试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 分组与造模将100只实验用大鼠随机分为假手术组，模型组，银杏内酯 B（15、30、60 mg/kg）组，每组20只。参照徐叔云等［5］报道的实验方法，通过夹闭左冠状动脉前降支30 min的方法建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，实验过程实施心电图监测，心电图示ST段抬高或T波高耸为心肌缺血，夹闭30 min后恢复血流灌注，抬高的ST段降低或高耸的T波得以恢复表示心肌再灌注成功。假手术组行手术通路但不夹闭冠状动脉。

1.4 给药方法银杏内酯 B（15、30、60 mg/kg）组腹腔注射给药治疗，每日1次，疗程7 d。假手术组，模型组同步腹腔注射生理盐水，每日1次。各组均造模后即刻给药。

1.5 标本采集与检测 1）超声检测。各组随机取10只大鼠，采用Vevo770高分辨率超声影像系统于取材前行超声检测。于左侧胸骨旁取左室乳头肌水平短轴切面，测量舒张末期左室内径（LVIDd）、收缩末期左室内径（LVIDs）、短轴缩短率（FS）、射血分数（EF）、每搏输出量（SV），所有检测指标均取连续3个心动周期的平均值。2）TCC染色法测定心肌组织梗死面积。取心脏组织置-20℃冻存20 min后切片，2%TTC溶液（恒温37℃、避光）孵育15 min，灰白色为梗死区，采用医用图像分析系统分析心肌组织梗死面积。3）血清中心肌酶含量的测定。经腹主动脉取血并离心（1500 r/min，10 min）取血清，通过生化分析仪测定血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量。4）心肌组织病变及心肌细胞凋亡的观察。取心脏组织并置于4%多聚甲醛溶液中72 h进行固定，经常规脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡水化处理后，HE染色并通过倒置光学显微镜观察心肌组织病变，TUNEL染色后通过倒置光学显微镜观察各组大鼠心肌细胞凋亡状况。凋亡指数（AI）计算：每张TUNEL染色切片选取不重叠的6个视野，分别计数每个视野中的细胞总数和凋亡细胞数，各组取平均值后计算 AI：AI（%）=（阳性细胞数/细胞总数）×100%

1.6 统计学处理应用SPSS15.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间均数两两比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心电图监测结果比较与假手术组大鼠比较，模型组及银杏内酯B各剂量组大鼠结扎左冠状动脉前降支后出现左心室前壁呈灰白，而后逐渐呈现紫绀的症状，心电图示ST段抬高或T波高耸，提示急性心肌梗死大鼠模型造模成功。经银杏内酯B干预治疗7 d后，缺血再灌注损伤大鼠心电图波形明显改善，其中银杏内酯B 60 mg/kg组心电图波形基本恢复正常。见图1。

图1 各组大鼠心电图

2.2 各组大鼠超声检测结果比较见表1。与假手术组大鼠比较，模型组大鼠LVIDd、LVIDs显著升高（P<0.05 或P<0.01），FS、EF、SV 显著降低（P<0.01）；而与模型组比较，银杏内酯 B 30、60 mg/kg组 LVIDd、LVIDs显著减小（P<0.05），FS 显著提高（P<0.01），EF、SV 显著升高（P<0.05或P<0.01）。

表1 各组大鼠超声检测结果比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别 n假手术组 10模型组 10银杏内酯B 15 mg/kg组 10 EF（%） SV（μL）72.81±7.34 190.25±24.80 29.37±4.50** 78.14±17.65**33.74±4.83 86.40±19.27银杏内酯 B 30 mg/kg组 10 6.87±0.22△ 5.47±0.35△ 26.08±5.42△△ 36.29±5.16△ 107.53±18.24△银杏内酯 B 60 mg/kg组 10 6.74±0.26△ 5.03±0.31△△ 28.62±5.83△△ 46.03±7.24△△ 119.02±21.51△△LVIDd（mm） LVIDs（mm） FS（%）6.68±0.25 3.90±0.28 42.95±7.16 7.23±0.27* 6.18±0.39** 15.34±3.28**7.01±0.30 5.92±0.43 18.71±4.15

2.3 各组心肌组织梗死面积测定结果比较见表2。模型组心肌组织梗死面积较假手术组显著升高（P<0.01）；银杏内酯B 30、60 mg/kg组梗死面积与模型组比较，显著降低（P<0.05或P<0.01）。

表2 各组大鼠血清心肌酶含量及心梗面积比较（±s）

2.4 各组心肌酶含量比较见表2。模型组血清心肌酶（AST、CPK、LDH）含量较模型组均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，银杏内酯B 30、60 mg/kg组血清AST、CPK、LDH含量均显著降低（P<0.05或P<0.01）。

2.5 各组心肌组织病变观察结果比较见图2。经HE染色后观察病理切片，假手术组心肌组织结构、细胞形态均未见明显异常；模型组心肌组织呈现肌原纤维断裂、排列紊乱，心肌细胞呈空泡变性，细胞质着色不均，胞核深染等病理性改变；与模型组比较，银杏内酯B 15、30、60 mg/kg组心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织病变呈现不同程度改善，以银杏内酯B 60 mg/kg组效果最为显著。

图2 各组大鼠心肌组织形态（HE染色，200倍）

2.6 心肌细胞凋亡状况观察结果经TUNEL染色后观察，模型组心肌细胞凋亡数量较假手术组明显增多；与模型组比较，银杏内酯B 15、30、60 mg/kg组心肌细胞凋亡数量明显减少，以银杏内酯B 60 mg/kg组最为显著，见图 3。模型组心肌细胞 AI［（57.42±9.76）%］较假手术组 AI（0）显著升高（P<0.01）；银杏内酯 B 15、30、60 mg/kg 组 AI分别为（46.08±7.93）%、（39.32±7.58）%、（26.72±5.89）%；与模型组比较，银杏内酯 B 30、60 mg/kg组AI显著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 讨论

随着高血压、高血脂等基础疾病发病率的提高，冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）以及由其所引发的急性心肌梗死（AMI）发病率逐年升高，严重危害着人类的生命健康［6-7］。及时通过药物或介入手术溶栓以实现血流恢复灌注是目前临床上治疗AMI的主要方案，但缺血再灌注损伤并发症严重影响着AMI预后。缺血再灌注损伤病理机制非常复杂，既往研究发现心功能异常、氧化应激损伤、炎症反应以及继发性心肌细胞凋亡是缺血再灌注损伤发生发展的重要病理机制［8-12］，这也为我们研发能够有效降低缺血再灌注损伤的新型药物提供了思路。

图3 各组大鼠心肌细胞凋亡状况（TUNEL，400倍）

心电图ST段抬高或T波高耸是急性心梗死的典型表现，本研究采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备急性心肌梗死大鼠模型，造模过程全程实施心电图监测，发现结扎左冠状动脉前降支后出现左心室前壁呈灰白、紫绀的症状，心电图示ST段抬高或T波高耸，提示造模成功。该造模方法操作简单、成功率高且与临床AMI症状接近，是目前AMI动物实验研究常用的造模方法［13］。银杏内酯B是我国传统中药银杏叶的主要活性成分之一，具有抗凋亡、抗氧化、抗炎等多种药理学作用［1-4，14-15］。本实验研究发现：经银杏内酯 B 治疗能够有效改善心肌缺血再灌注损伤大鼠心电图波形，有效降低 LVIDd 和 LVIDs，提高 FS、EF、SV；显著降低血清心肌酶（AST、CPK、LDH）含量，改善心肌组织病变，减小心肌组织梗死面积，提示银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

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