冠脉结扎术制备大鼠慢性心衰模型的实验改良*

李文佳 王冰梅 蔺禹帆 王星烨 郭 迪 王 迪△

（1.长春中医药大学基础医学院，吉林 长春 130000；2.长春中医药大学临床医学院，吉林 长春130117）

·实验报告·

冠脉结扎术制备大鼠慢性心衰模型的实验改良*

李文佳1王冰梅1蔺禹帆1王星烨2郭 迪1王 迪1△

（1.长春中医药大学基础医学院，吉林 长春 130000；2.长春中医药大学临床医学院，吉林 长春130117）

目的改良冠脉结扎术制备大鼠慢性心衰模型。方法60只SD大鼠随机分为假手术组10只和手术组50只，大鼠麻醉后，经口气管插管，连接呼吸机，开胸，结扎左侧冠状动脉前降支（假手术组只穿线不结扎），关胸缝合，6周后观察两组大鼠的心电图变化、存活率、心体比、血流动力学及心肌组织结构的变化。结果手术组50只大鼠6周后存活39只，存活率为78.00%；术后手术组心电图ST段明显抬高；6周后手术组较假手术组左室收缩压（LVSP）和最大上升速率（+dp/dtmax）均下降，左室舒张末压（LVEDP）和最大下降速率（-dp/dtmax）均上升（P<0.05）；HE染色及心肌组织电镜可见手术组心肌结构发生明显变化。结论改良冠脉结扎术提高了术后大鼠的存活率，在一定程度上为成功制备慢性心衰模型提供了更大的可能。

冠脉结扎 大鼠 慢性心衰 存活率

慢性心力衰竭（CHF）是一种极其复杂的临床综合征，是各种心血管疾病发生发展的终末阶段，是导致心血管疾病死亡的主要原因［1］。欧洲调查结果显示，心衰患者占其总人口的0.4%～2.0%，其中大约一半的患者在4年内死亡［2］。我国50家医院住院病例调查显示，慢性心衰的住院率占同期心血管病的20%，死亡却占40%［3］。可见慢性心力衰竭已成为严重影响人类健康的一大疾病。研究及开发出治疗慢性心衰新型药物也迫在眉睫。实验室建立及制备慢性心衰动物模型能为临床药物研究提供有效的动物实验模型。冠脉结扎法是制备慢性心衰模型的重要方法。该种方法制备的相关模型与临床相关疾病的病理发展过程及发生机制有很高的相似性，因而得到广泛应用［4］。但其造模方法难度较高，过程复杂，易受多种因素影响从而导致存活率及成模率高低不一［5-6］。本文针对上述问题查阅近10年相关文献，综合各方经验，在实验过程中不断摸索总结，改进实验方法，提高了大鼠冠脉结扎术后的存活率，从而为提高相关模型制备的成功率提供了参考。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠60只，体质量（200±20）g，辽宁长生生物技术有限公司提供，动物合格证号：211002300013347，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，适应性喂养2周后随机分为假手术组10只，手术组50只。

1.2 试剂与仪器 10%水合氯醛（水合三氯乙醛1.0 g加0.9%氯化钠注射液10 mL，无菌微孔针式过滤器过滤，封瓶备用）；注射用青霉素钠160万U/支（哈药集团制药总厂，产品批号：15110403-2）；2.5%戊二醛（吉林大学电镜室提供）。HX-100E小动物呼吸机（成都泰盟软件有限公司）、PowerLab八通道生理记录仪（澳大利亚ADInstruments公司）、手术器械（均高温灭菌）。

1.3 动物麻醉 手术前1 h禁食，不禁水。术前称体质量，左下腹碘伏消毒，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射［7］。麻醉完全后，将大鼠固定在大小适中的鼠板上，连接心电图，心电图正常者继续实验，不正常者淘汰。

1.4 气管插管 将鼠板垂直放置，大鼠呈头高脚低位，止血钳夹住舌尖自然垂下暴露口腔，左手执LED压舌板伸入舌根部下压，可见一张一合呈呼吸节律的声门，待声门张开时右手执气管插管插入气道，插入时有卡顿感，连接呼吸机（设置潮气量为6 mL/min，呼吸时比为 1∶1［8］，呼吸频率为 70 次/min，通入气体为空气），可见胸廓上下起伏即可确定进入气管。插管成功后用胶布固定以防术中脱出。

1.5 冠脉结扎 大鼠取仰卧位，备皮区域纵向为左胸2～5肋，横向为胸骨至腋前线之间，局部碘伏消毒，铺一次性无菌洞巾。纵行切开皮层，逐层钝性分离胸大肌和前锯肌，显露肋骨，在心脏搏动最明显的肋间隙（3～4肋间）用弯钳轻轻扎破肋间肌及胸膜，张开弯钳将心脏拉钩插入，暴露视野可见心脏及随呼吸机频率收缩及舒张的左侧肺叶。为避免挤出心脏时损伤肺叶，故在心脏与左肺之间放一带线的无菌棉球 （生理盐水浸湿，用前将棉球挤至无水）将肺压向左侧胸腔。用弯镊子轻轻滑过心尖将心包膜挑破，用心脏拉钩轻轻将心脏挤出，可见左心耳及肺动脉圆锥。以6/0缝合线于左心耳根部下方约2 mm处进行结扎［9］，进针深度约0.5～1 mm，宽约 1～2 mm［10］。 结扎后将心脏小心送回胸腔，拉出带线棉球，观察心电图变化。假手术组只在左心耳根部下方进针穿线，不结扎，其他步骤与手术组相同。

1.6 关胸及术后处理 大鼠心脏节律规整后缝合肋骨，注射器吸取胸腔内气体及血液，恢复胸腔负压，逐层缝合肌层及皮层，每层均敷适量青霉素钠粉，无菌纱布包扎。撤掉呼吸机，胸外按压辅助恢复自主呼吸，待呼吸、心率平稳后拔下气管插管。观察3～5 min无异常将大鼠放入单笼中室温饲养。术后第2天每只大鼠给予腹腔注射青霉素4万U/d，连续注射3 d以预防术后感染。

1.7 观察指标 1）结扎前后心电图变化：取大鼠冠脉结扎前及结扎后5 min的心电图，心电图显示标准肢体Ⅱ导联ST段明显抬高（≥0.1 mV），表明冠脉结扎成功。2）术后6周存活率：观察并统计手术组及假手术组术后6周大鼠的存活情况，计算存活率。3）血流动力学改变：术后正常喂养6周后从手术组中采取抽签法随机选取9只大鼠，与假手术组大鼠均禁食不禁水1 h后称体质量麻醉，进行右侧颈动脉插管术，操作方法参照文献［11］并稍作改进，记录 LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax，统计并分析大鼠血流动力学变化。4）心体比：血流动力学指标检测完毕后取心脏称重，计算心体比，心脏质量（mg）/体质量（g）＝心体比。 5）病理切片鉴定：术后6周取心脏，结扎部位下2 mm处进行横切，结扎端甲醛固定，石蜡包埋切片，病理切片厚度均为4 μm，HE染色后光镜下观察。6）心肌微观结构观察：取心尖组织用2.5%戊二醛固定，切片，电镜下观察心肌细胞结构。

1.8 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 手术前后心电图变化 见图1，图2。术中观察心电图变化，可见冠脉结扎后心电图ST段明显抬高（如箭头所示）。假手术组心电图无明显变化。可证明手术组结扎成功。

图1 手术组大鼠术前术后Ⅱ导联变化

2.2 两组术后6周存活率比较 本实验手术组选用雌性SD大鼠50只，术中心室颤动死亡4只，呼吸衰竭死亡2只，术后2 h因呼吸道阻塞死亡1只，术后1 d因心衰死亡1只，呼吸道阻塞死亡1只，术后15、16 d因慢性心衰分别死亡1只，术后6周总存活率为78.00%。假手术组术中因心律失常死亡1只，术后6周存活率为90.00%。

2.3 两组心体比及血流动力学改变比较 见表1。与假手术组相比，手术组心体比明显增高，LVSP与+dp/dtmax明显降低，LVEDP与-dp/dtmax明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。从心体比及血流动力学指标可见手术组造模成功。

表1 两组心体比及血流动力学改变比较（±s）

表1 两组心体比及血流动力学改变比较（±s）

与假手术组比较，△P<0.05。

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2.4 两组心肌细胞石蜡切片HE染色结果 见图2。假手术组石蜡切片HE染色可见肌丝排列整齐，有分叉，肌纤维无断裂扭曲，细胞着色均匀，细胞核位于细胞的中央，核大小及形态正常。手术组切片可见肌丝排列紊乱交织成网状，部分肌纤维扭曲断裂，细胞着色不均匀，部分细胞核固缩，核周围可见空白区。

图2 两组心肌细胞比较（HE染色，40倍）

2.5 两组心肌细胞电镜结果 见图3。假手术组可见肌丝排列紧密整齐，肌节明显，明暗带清晰，肌丝间可见单排线粒体排列整齐，形态规则，无肿胀。手术组可见肌丝排列疏松紊乱，部分肌丝断裂，肌丝间线粒体数目明显增多，排列紊乱，线粒体形态不规则，部分线粒体固缩变小。

图3心肌组织电镜（1000倍）

3 讨 论

通过实验发现，综合优化实验大鼠选择、术中通气管理、术中处理、脱机管理等可提高冠脉结扎大鼠存活率。

3.1 实验大鼠选择 在进行正式实验前进行预实验，发现大鼠适应性喂养天数与造模存活率有一定的相关性。实验过程中均采用SPF级雌性SD大鼠，体质量（200±10）g。手术起初新进大鼠适应性喂养3 d，术中发生室性心动过速，心脏骤停，心室颤动者居多，死亡率较高。术后也易发生呼吸衰竭、心功能衰竭导致死亡。适应性喂养1周，术中大鼠耐受性较前增强，恶性心律失常风险下降，术后猝死率降低，但术中及术后存活率仍不理想。为观察大鼠适应性喂养时间与手术存活率的关系，将大鼠分别适应性喂养10、14 d后行冠脉结扎术，发现适应性喂养14 d后大鼠术中及术后存活率均提高，术中心律失常风险亦明显下降。本实验发现适应性喂养2周，体质量（250±10）g时进行冠脉结扎术存活率最高（见表2）。有鉴于此，本实验均采用适应性喂养2周的大鼠进行结扎。

表2 适应性喂养天数及死亡关系

3.2 术中通气管理 以往研究表明，术中呼吸管理大致采用3种方法，不插管、有创插管、经口腔无创插管。李贻奎等采用术中不插管，从开胸、结扎到缝合要求在10 s左右完成，对术者手法要求较高，且存活率不能保证［12］。有创插管分气管切开和注射针头直接刺入气管［13］两种，气管切开法插管虽然直观、准确，但容易因出现气道出血和分泌物过多而导致窒息，术后气管切口缝合不当还容易造成气管狭窄或气管瘘，术后肺部感染的可能性增大［14］；注射针头直接插入气管虽可降低因气管切开所致的分泌物增多阻塞呼吸道的风险，但两者同样颈部切开增加了大鼠感染的几率，延长了术后大鼠恢复的时间。

经口腔无创插管，对大鼠气道创伤小，术中通气稳定，术后易恢复，但口腔内光线暗，不易观察到气管，影响插管成功率，王学文等［15］采用颈部强光照射经口腔插管，但发现口腔视野仍较差，不直观，不能准确判断气管位置。本实验采用LED压舌板，可直观清晰的看到气管位置，声门开合，在声门打开时将气管插管插入气道，大大提高了气管插管的成功率。

3.3 术中处理 文献中实验开胸后为预防伤及肺叶多采用普通棉球或纱布放置于心脏与左肺之间，将心脏放回胸腔后容易将棉球及纱布遗留在胸腔内；在用镊子或止血钳将棉球拿出时亦容易损伤心脏、血管及肺叶，故本实验采用带线棉球，可在结扎结束后直接将棉球拉出，避免了上述问题，方便省时且安全，亦可提高手术的成功率。

3.4 脱机管理 因开胸缝合后胸内负压不能完全恢复，脱机后难以自行恢复自主呼吸，本实验采用试探性脱机后胸外按压刺激大鼠恢复自主呼吸，多数大鼠可恢复自主呼吸［16］。若脱机后动物出现呼吸表浅缓慢及呼吸骤停，则立即重新连接呼吸机辅助呼吸，并配合胸外按压，必要时反复脱机以促使恢复自主呼吸，实验证实操作可行。

综上所述，本实验通过以上方法的改进有效地提高了冠脉结扎术后大鼠的存活率，且饲养6周后各项观察指标均达到慢性心衰诊断标准，为提高慢性心衰模型制备的成功率提供了参考。

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Experimental Improvement of Chronic Heart Failure Model Induced by Coronary Artery Ligation in Rats

LI Wenjia，WANG Bingmei，LIN Yufan，et al. Changchun University of Chinese Medicine，Jilin，Changchun 130117，China.

Objective：To establish a rat model of chronic heart failure by modified coronary artery ligation.Methods：60 SD rats were randomly divided into sham operation group（n=10） and the operation group（n=50）.After anesthesia，the rats were intubated by mouth，connected to the ventilator，opened the chest and ligated the anterior descending branch of the left coronary artery （the sham group's line was not ligated），land ayer by layer closed chest.After 6 weeks，the changes of ECG，survival rate，ratio of heart to body，hemodynamics and myocardial tissue structure were observed in the operation group and sham operation group.Results：After 6 weeks，only 39 survived in 50 SD rats in the operation group；the survival rate was 78.00%.ECG of the operation group showed ST-segment elevation.After 6 weeks，compared with the sham group，both left ventricular systolic pressure（LVSP） and the maximum rise rate（+dp/dtmax） decreased in the operation group；both left ventricular end diastolic pressure（LVEDP） and the maximum decline rate（-dp/dtmax） increased（P<0.05）.HE staining and myocardial tissue electron microscopy showed significant changes in myocardial tissue structure of the operation group.Conclusion：The improved coronary artery ligation improves the survival rate of rats after operation，and provides a greater possibility for the successful preparation of chronic heart failure models.

Coronary ligation；Rat；Chronic heart failure；Survival rate

R541.4

A

1004-745X（2017）11-1973-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.027

吉林省科技厅国际合作项目（20140414054GH）

△通信作者（电子邮箱：wangdi0606＠126.com）

2017-06-28）