肾病Ⅰ号方对单侧输尿管梗阻大鼠Wnt通路Wnt4和β-catenin表达的影响*

林文博 程锦国△ 陈建欧 武亚丹 李 晓

（1.浙江中医药大学附属温州中医院，浙江 温州 325000；2.浙江中医药大学附属第三医院，浙江 杭州 310005）

肾病Ⅰ号方对单侧输尿管梗阻大鼠Wnt通路Wnt4和β-catenin表达的影响*

林文博1程锦国1△陈建欧1武亚丹1李 晓2

（1.浙江中医药大学附属温州中医院，浙江 温州 325000；2.浙江中医药大学附属第三医院，浙江 杭州 310005）

目的研究肾病Ⅰ号方对Wnt通路中Wnt4和β-catenin表达的影响及肾病Ⅰ号方抗肾纤维化的机理。方法雄性SPF级SD大鼠108只，随机分为假手术组、模型组、西药组（盐酸贝那普利）、肾病Ⅰ号方高、中、低剂量组，每组18只。假手术组仅游离左侧输尿管，其余5组行左侧输尿管结扎术，于术后第2天灌胃。各组分别于灌胃后第7、14、21天随机选取6只大鼠留取24 h尿液，检测24 h尿蛋白（24 h UP）；心脏取血，检测血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）；处死大鼠，取肾脏组织行Masson染色，光学显微镜下观察肾脏组织病理改变；免疫组化方法观察Wnt4和β-catenin在肾间质的阳性表达情况。结果模型组和给药组大鼠血Scr和BUN较假手术组显著升高 （P＜0.05），24 h UP无统计学差异 （P＞0.05），Masson染色示蓝色胶原组织增多，Wnt4和β-catenin表达增加（P＜0.05）。西药组和肾病Ⅰ号方高、中、低剂量组大鼠血Scr和BUN较模型组显著降低 （P＜0.05），24 h UP差异无统计学意义 （P＞0.05），Masson染色示蓝色胶原组织减少，Wnt4和 βcatenin表达降低（P＜0.05）。与西药组比较，肾病Ⅰ号方高、中、低剂量组大鼠各检测指标无统计学差异（P＞0.05）。结论肾病Ⅰ号方可保护肾小管，并可能通过降低肾小管上皮细胞中Wnt4和β-catenin的表达，减少细胞外基质堆积，从而达到抗肾纤维化的作用。

肾病Ⅰ号方 单侧输尿管梗阻 肾纤维化 Wnt4 β-catenin

近年来，慢性肾脏病（CKD）患病率和死亡率不断升高，严重威胁人类生命和健康。最新研究表明，高收入国家的CKD患病率一直在11%左右［1］，我国CKD患病率为10.8%［2］，并且逐年增高。大多数CKD最终都发展为肾脏纤维化［1］，肾纤维化以肾间质中炎性细胞浸润和细胞外基质（ECM）积聚为主要特点，伴肾小球硬化、肾小管萎缩和扩张，肾单位进行性破坏等病变。中医药在预防和治疗肾纤维化上具有明显优势。肾病Ⅰ号方为温州市中医院自拟方，具有疏利三焦，祛三焦邪浊之功效。临床实践证明，肾病Ⅰ号方抗肾纤维化体现较好的疗效［3］。本研究以单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠为研究对象，探究肾病Ⅰ号方对UUO模型大鼠肾纤维化的改善作用，观察其对Wnt通路中Wnt4和β-catenin表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 108只清洁级雄性健康SD大鼠，体质量（200±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.2 药物与试剂 肾病Ⅰ号方（柴胡、黄芩、半夏、白芍、土茯苓、半枝莲、菝葜、漏芦等）经常规煎煮、过滤、水浴蒸发等步骤，浓缩至生药含量分别为0.75、1.5、3 g/mL规格，由浙江中医药大学饮片厂炮制中心提供；盐酸贝那普利片（产品批号：X2342，北京诺华制药有限公司）；抗 Wnt4 抗体（abcam）；抗 β-catenin 抗体（Cell Signaling Technology）；Masson 染色试剂盒（北京索莱宝生物科技公司）；DAB显色试剂盒、超敏二步法免疫组化检测试剂盒 （北京中杉金桥公司）。BX51光学显微镜，日本Olympus公司；微量加样枪，德国Eppendorf公司；Coulter AU5800全自动生化分析仪，美国Beckman公司。

1.3 分组与造模 实验大鼠适应性喂养1周后随机分为假手术组18例和造模组90例。实验采取单侧输尿管结扎术建立实验动物模型［4］：称体质量，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，取右侧卧位，手术区备皮。从背部脊柱距离左侧肋脊角1.5 cm处做切口，开腹暴露左侧肾脏，游离输尿管，于约肾盂处和输尿管上1/3处双重结扎，回纳肾脏并逐层缝合。造模组随机分为模型组，西药组，肾病Ⅰ号方高、中、低剂量组，每组9只。

1.4 给药方法 造模后第2日开始灌胃，假手术组、模型组给予10 mL/kg 0.9%氯化钠注射液。肾病Ⅰ号方给药体积为10 mL/kg。肾病I号方高、中、低剂量分别按照体质量为60 kg的成人每日生药剂量的20、10、5倍（灌胃生药剂量分别为3、1.5、0.75 g/mL的浓缩液）计算。西药组给予盐酸贝那普利 0.8 mg/kg（0.08 mg/mL）［5］。每日早晚灌胃各1次。

1.5 标本采集 每组大鼠分别于灌胃第7、14、21日后随机选取6只处死。处死前放入代谢笼中收集24 h尿液，记录尿量，离心沉淀后取上清液检测24 h尿蛋白。采用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，采血针心脏取血3 mL，离心后取血清保存于-20℃冰箱。摘取大鼠梗阻肾，去包膜，分切肾组织，一部分于4%多聚甲醛溶液中固定，其余肾脏组织置于液氮速冻保存。

1.6 标本检测 1）血尿生化指标。将收集的24 h尿液采用免疫比浊法测24 h尿蛋白。心脏取血收集的血液送检至温州市中医院检验科，检测血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）。2）肾脏病理学检测方法。肾组织经4%多聚甲醛溶液固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成3 μm石蜡切片，按常规方法行Masson染色，光镜下观察肾组织病理学改变。3）免疫组化检测方法。石蜡切片常规脱蜡水化，双氧水室温静置10 min后高压热修复，滴加山羊血清封闭液（室温封闭20 min），滴加一抗，抗 Wnt4（1∶400）、β-catenin（1∶200），4℃过夜。根据超敏二步法免疫组化检测系统滴加二抗，室温静置15 min。DAB显色水洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。400倍光镜下观察，每张切片随机选取5个非重叠视野，拍照；采用Image Pro Plus 6.0软件对采集图像进行平均累积光密度值（IOD值）分析，以反映Wnt4和β-catenin表达量。

1.7 统计学处理 应用SPSS23.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法（LSD），方差不齐时采用Dunnett T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血、尿生化检测结果比较 见表1，表2。模型组和各处理组大鼠血清Scr和BUN浓度明显高于假手术组 （P<0.05）。西药组和中药组大鼠血清Scr和BUN浓度显著低于模型组（P<0.05）。肾病Ⅰ号方高、中、低剂量组之间比较，血清Scr和BUN差异无统计学意义（P＞0.05）。24 h尿蛋白各组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠血清Scr和BUN水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清Scr和BUN水平比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）组 别7 d 14 d 21 d 7 d 14 d 21 d假手术组 17.67±2.08 19.67±2.52 19.33±3.21 5.38±0.61 5.08±0.49 5.78±0.42模型组 38.00±3.61*西药组 27.00±5.66*△40.00±1.41*42.67±6.43*29.00±3.61*△ 30.33±4.04*△8.42±0.74*6.61±0.68*△10.89±0.53* 11.73±0.62*7.07±0.24*△ 9.00±0.37*△中药高剂量组 28.33±4.73*△ 29.00±6.93*△ 30.67±2.08*△ 7.38±0.46*△ 8.54±1.25*△ 9.42±0.75*△中药中剂量组 27.33±4.16*△ 28.33±1.53*△ 31.33±2.08*△ 7.34±0.29*△ 8.79±1.12*△ 9.51±0.34*△中药低剂量组 28.67±2.08*△ 29.67±2.08*△ 32.33±1.53*△ 6.61±0.31*△ 8.05±1.23*△ 9.85±0.26*△

表2 各组大鼠24 h尿蛋白水平比较（mg/L，±s）

表2 各组大鼠24 h尿蛋白水平比较（mg/L，±s）

组 别 7 d 14 d 21 d假手术组 277.6±136.57 493.67±55.37 624.67±78.65模型组 581.3±131.80 638.50±139.30 881.33±131.80西药组 326.00±69.30 541.33±335.40 607.67±131.61中药高剂量组 448.6±215.23 277.33±260.77 478.67±209.48中药中剂量组 460.0±238.43 338.00±178.55 457.33±223.72中药低剂量组 338.6±235.77 489.00±346.00 526.33±368.80

2.2 各组大鼠肾脏组织病理变化 见图1。Masson染色结果显示，假手术组肾组织仅有微量蓝染胶原组织；织蓝色胶原纤维减少，说明肾纤维化程度减少。而造模组肾组织可见大量蓝染胶原组织，且梗阻时间越长，蓝染组织越多，提示肾纤维化进行性加重。与假手术组比较，西药组和肾病Ⅰ号方组肾脏蓝染胶原组织增加；而与模型组比较，西药组和肾病Ⅰ号方组肾组

图1 各组大鼠肾组织病理学改变（Masson染色，400倍）

2.3 各组肾脏组织Wnt4阳性表达水平比较 见图2，表3。假手术组，Wnt4在肾组织内不表达或有微量表达。与假手术组比较，各造模组在肾小管上皮细胞胞质和肾小球内Wnt4阳性表达量显著升高（P<0.05），且梗阻3周内，梗阻时间与阳性表达量呈正相关。与模型组相比，肾病Ⅰ号方各组和西药组Wnt4表达量均有降低（P<0.05）。

表3 各组大鼠肾脏组织Wnt4和β-catenin蛋白在不同时间表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠肾脏组织Wnt4和β-catenin蛋白在不同时间表达水平比较（±s）

与中药低剂量组比较，＃P＜0.05。

Wnt4 β-catenin组 别7 d 14 d 21 d 7 d 14 d 21 d假手术组 18.99±2.60 25.01±3.49 31.97±5.71 11.66±2.73 20.32±8.57 28.79±9.21模型组 117.37±5.60*西药组 36.07±4.98*△＃152.35±21.43*227.94±18.53*59.30±9.03*△ 89.90±19.53*△107.71±16.17*31.97±3.48*△＃136.85±12.36*181.70±9.51*52.42±9.73*△ 74.90±6.64*△中药高剂量组 40.94±7.98*△＃ 67.20±5.53*△ 95.68±16.52*△ 32.23±9.10*△ 47.19±13.37*△ 77.48±6.71*△中药中剂量组 47.19±4.96*△ 73.58±12.39*△ 90.35±13.18*△ 32.81±9.91*△ 53.43±9.20*△ 76.49±10.06*△中药低剂量组 52.83±9.39*△ 76.08±11.30*△ 112.71±12.03*△ 39.07±6.78*△ 60.33±7.45*△ 85.34±10.10*△

2.4 各组肾脏组织β-catenin阳性表达变化比较 见图3，表3。假手术组肾组织中可见β-catenin的微量表达。与假手术组比较，各造模组在肾小管上皮细胞胞质和细胞核内β-catenin表达量明显升高（P<0.05），且梗阻时间越长，β-catenin表达量越多。与模型组相比，肾病Ⅰ号方各组和西药组β-catenin表达量均有降低（P<0.05）。

3 讨 论

肾纤维化是CKD进展至终末期肾脏病的主要病理特征和共同通路。其由多种细胞因子介导、多种信号通路转导，导致ECM在肾间质大量堆积、肾脏组织结构破坏及功能丧失的病理过程［6］。近年来研究证实，Wnt信号通路在纤维化疾病过程中发挥着重要作用［7-8］。Wnt/β-catenin通路是Wnt信号通路中的经典通路。该通路由分泌蛋白Wnt家族、胞膜受体卷曲蛋白（FZD）家族、胞浆内β-catenin（连环链蛋白）等多种蛋白分子和细胞核内T细胞因子（TCF）/淋巴样增强因子（LEF）转录因子家族等组成［7］。

图2 Wnt4免疫组化结果（400倍）

图3 β-catenin免疫组化结果（400倍）

目前，在多种动物体内发现了包括Wnt4在内的19种 Wnt蛋白［9］。Wnt信号通路激活使得 Wnt蛋白异常表达［10］。 Nguyen 等［11］首次在 UUO 大鼠模型中发现Wnt4的表达，并且Wnt4与肾纤维化程度呈正相关。同样在UUO模型中，Surendran等［12］发现在肾脏组织集合管中有Wnt4的阳性表达，并且随着纤维化的出现，间质成纤维细胞中Wnt4呈现高水平阳性表达，梗阻期间可持续升高4周。由此可以推断，肾纤维化的发生和进行性发展可能与Wnt4异常表达有关。在Wnt途经中，β-catenin-TCF/LEF复合体是Wnt途经的枢纽。Wnt信号激活后，Dishevelled蛋白通过抑制糖原合成激酶3β（GSK-3β）等蛋白形成的β-catenin降解复合物的降解活性，使细胞质中游离的β-catenin蛋白增多。胞浆中积累的β-catenin进入细胞核，与TCF/LEF转录因子家族结合，启动下游靶基因的转录［13-15］，激活纤维化相关基因的表达，促进肾纤维化的发生。

肾纤维化可归属于中医学“水肿”“腰痛”“溺毒”等范畴，其病因错综复杂，但根本病机为本虚标实，虚实夹杂。《难经》云“三焦者，水谷之道路”并“主持诸气”；《内经》云，三焦可通调水道，为人体决渎之官。脾肾虚损和湿热、瘀血、浊毒等阻碍三焦通行诸气、运化水液，使三焦枢机不利；反过来，三焦枢机不利又会损耗人体正气，加重湿热、瘀血等病邪，故以疏利三焦，祛三焦邪浊立肾病Ⅰ号方［16］。肾病Ⅰ号方为温州市中医院自拟方，以小柴胡汤主药柴胡、半夏、黄芩为君，主入三焦，疏利三焦，调畅三焦气血水液，配以土茯苓、半枝莲清热除湿解毒，菝葜解毒散瘀，白芍扶正补虚，共奏畅三焦枢机、祛三焦邪浊、扶正补虚之功。课题组前期研究表明，肾病Ⅰ号方可下调IL-6 mRNA表达，抑制肾小球系膜细胞增殖，进而减少ECM（主要是FN）的产生，从而达到抗肾纤维化的作用［3］。

本研究结果表明，肾病Ⅰ号方可降低肾纤维化大鼠Scr和BUN，降低肾小管上皮细胞中Wnt4和βcatenin的表达，一定程度上改善大鼠肾脏组织的病理表现，保护肾小管，减少ECM堆积，从而达到抗肾纤维化的作用。但肾纤维化的信号通路较多，发生发展的机制复杂，肾病Ⅰ号方对其他信号通路及机制的影响需要进一步探索。

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Effect of Nephropathy 1st Decoction on Expression of Wnt4 and β-catenin in Wnt Signaling Pathway of Unilateral Ureteral Obstruction Rats

LIN Wenbo，CHENG Jinguo，CHEN Jianou，et al. Affiliated Wenzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang，Wenzhou 325000，China.

Objective：To study the effect of Nephropathy 1st Decoction on the expression of Wnt4 and βcatenin in Wnt pathway and the mechanism.Methods：The male Sprague-Dawley （SD） rats （108 cases） were randomly divided into the sham-operated group，the model group，benazepril hydrochloride group，high-，med-，low-dose Nephropathy 1st Decoction groups （HN，MN，and LN groups），18 in each group.In the sham operation group，only the left ureter was free；the remaining 5 groups underwent left ureteral ligation，and the gastric lavage was performed on the second day after operation.On days 7，14，21，6 rats in each group were randomly sacrificed.24 h urine protein（24 h UP），serum blood urea nitrogen（BUN） and serum creatitine（Scr） were tested.Also their left surgery renal tissues were collected for pathological examination.The pathological changes of the obstruction renal tissue were examined by Masson staining.The protein expression of Wnt4 and β-catenin was detected by immunohistochemical staining.Results：Compared with the sham-operated group，serum levels of BUN and Scr in other groups were increased（P＜0.05）；there was no significant difference in 24 h UP（P>0.05）.Masson staining showed that the number of blue collagen increased，and protein expression level of Wnt4 and βcatenin increased（P＜0.05）.Compared with the model group，after the treatment，serum levels of SCr and BUN in rats decreased significantly in other groups （P＜0.05）；there was no significant difference in 24 h UP （P>0.05）.Masson staining showed that blue collagen was decreased，and the expression of Wnt4 and β-catenin was decreased（P＜0.05）.Compared with benazepril hydrochloride group，there were no significant differences in the in-dexes of high，medium and low dose groups of Nephropathy 1st Decoction （P>0.05）.Conclusion：Nephropathy 1st Decoction may protect renal tubules，and may reduce the accumulation of extracellular matrix by reducing the expression of Wnt4 and β-catenin in renal tubular epithelial cells，so as to achieve the role of anti-renal fibrosis.

Nephropathy 1st Decoction；Unilateral ureteral obstruction；Renal interstitial fibrosis；Wnt4；β -catenin

R285.5

A

1004-745X（2017）11-1938-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.016

浙江省药学重中之重一级学科开放基金（YKFJ005）；2015年温州市中医药建设资助项目

△通信作者（电子邮箱：wsjcjg@126.com）

2017-05-23）