心痛方对急性心肌梗死大鼠MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达的影响*

谢荣苑 范金茹 周斐然 陈 彤 王建湘 欧阳过 廖建萍 刘志云

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

心痛方对急性心肌梗死大鼠MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达的影响*

谢荣苑1范金茹2△周斐然2陈 彤2王建湘2欧阳过1廖建萍2刘志云1

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

目的通过观察心痛方对大鼠急性心肌梗死（AMI）后基质金属蛋白酶-9（MMP-9）mRNA和金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）mRNA表达及对心肌形态学的影响，探讨心痛方治疗AMI的疗效机制。方法80只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、心痛方组、双抗组（阿司匹林+氯吡格雷），冠脉结扎法制备AMI模型，灌胃给药7 d后处死大鼠，运用RT-PCR法测定心肌组织MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表达，心肌细胞HE染色观察形态学改变。结果心痛方能使AMI大鼠心肌内MMP-9 mRNA表达减少 （P＜0.01）；TIMP-1 mRNA表达升高（P＜0.01）；MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值降低（P＜0.01）；心肌损伤程度及心梗面积与MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值呈正直线相关。结论心痛方对AMI缺血心肌具有保护作用，其作用机制可能与增加TIMP-1 mRNA表达，降低MMP-9 mRNA表达，从而调节MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的平衡有关。

急性心肌梗死 心痛方 MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA

细胞外基质（ECM）是心脏和心血管壁的主要成分，基质金属蛋白酶（MMPs）和金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）与多种心血管疾病的发生与发展过程相关，在动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）的发病机制中起重要作用［1］。MMPs是炎症活动的产物，炎性细胞因子可激活巨噬细胞使MMPs产生增多，同时某些细胞因子下调TIMPs的产生，使 MMPs/TIMPs的比例失衡［2］。 本研究通过观察心痛方对急性心肌梗死（AMI）大鼠心肌组织MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA的表达以及对心肌组织结构改变的影响来探讨心痛方的疗效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠80只，体质量200～250 g，鼠龄8～10周，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK（湘）2014-0011。

1.2 试药与仪器

心痛方（组方：柴胡 10 g，瓜蒌 10 g，川芎 10 g，桃仁 10 g，蒲黄 10 g，白芥子 10 g，郁金 10 g，九香虫 5 g，甘草5 g），购于湖南中医药大学第一附属医院中药房，由湖南中医药大学心血管实验室统一煎制成浓缩汤剂（含生药0.652 g/mL）。阿司匹林（拜耳医药保健有限公司生产，批号：BJ33812）；氯吡格雷（深圳信立泰药业股份有限公司生产，批号：FF17090）；RNA提取试剂Trizol Reagent（由Invitrogen Life Technologies公司提供，批号：15596-026）；荧光定量PCR仪（上海宏石医疗科技有限公司）；PCR试剂盒、PCR引物 （武汉谷歌生物试剂有限公司提供）。

1.3 分组及造模

按体质量分层，再按随机表随机分组，分为假手术组、模型组、心痛方组、双抗组（阿司匹林+氯吡格雷），各20只。根据改进的大鼠AMI模型制备法［3］对模型组、心痛方组及双抗组大鼠进行造模。以左心室前壁颜色变白和运动减弱且心电图显示Ⅱ导联ST段弓背向上抬高≥0.1 mV或出现病理性Q波为结扎成功的标志（S-T段无改变者淘汰）。假手术组仅开胸，不结扎。术后7 d假手术组存活17只，模型组存活13只，心痛方组存活15只，双抗组存活14只。

1.4 给药方法

造模（或假手术）后2 h开始给药，以60 kg人临床用药量为标准，参照剂量-体表面积换算方法计算大鼠给药量，药物浓度按1 mL/100 g体质量配制。心痛方组予心痛方 6.52 g/kg，双抗组予阿司匹林 13.05 mg/kg、氯吡格雷26.10 mg/kg，模型组和假手术组分别予等量生理盐水灌胃。每日1次，连续7 d。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 心肌病理组织学检测并心肌损伤程度评分及心梗面积测定 灌胃给药7 d后处死大鼠，取各组大鼠心肌梗死区组织，将组织浸没于4%多聚甲醛中24 h固定，取出固定材料常规脱水、透明、浸蜡包埋、切片，进行苏木素-伊红（HE）染色。观察心肌病理学变化，并于光镜下根据心肌形态学改变进行心肌损伤程度评分［4］：心肌纤维排列整齐、无炎症细胞浸润、无坏死记0分；心肌纤维凝固性坏死并出现轻度炎症细胞浸润记1分；大量心肌纤维出现凝固性坏死并重度炎症细胞浸润记2分。用计算机图像分析系统测定每张HE染色切片上的梗死区面积，计算心梗部分占心肌横断面面积的百分比。

1.5.2 逆转录 PCR（RT-PCR）检测心肌 MMP-9mRNA、TIMP-1 mRNA表达水平 取100 mg心肌组织加入Trizol试剂1 mL，按产品说明步骤提取心肌总RNA。引物序列如下。 MMP-9（283 bp）：上游 5′-GCAAACCCTGCGTATTTCCATT-3′； 下游 5′-GCGATAACCATCCGAGCGAC-3′。TIMP-1（326bp）：上游 5′-TAAAGCCTGTAGCTGTGCCC-3′； 下游 5′-CATAACGCTGGTA TAAGGTGGTC-3′。 GAPDH（482 bp）：上游 5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′， 下游 5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′。 RT-PCR 反 应 体 系 ：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mol/L MgCl21.5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Taq 酶 0.2 U，cDNA 2 μL，引物量 10 pmol。 总体系25 μL。反应条件：94℃ 5 min，然后进入PCR循环，94℃预变性30 s，分别于60℃和58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环33次后再延伸5 min。取PCR产物5 μL于1.5%琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像系统上扫描，测定各目的基因和GAPDH扩增产物的吸光度值，分别计算其比值。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA检测结果 见表1。结果示，假手术组MMP-9 mRNA表达最少（P＜0.01）。模型组MMP-9 mRNA表达较假手术组明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，心痛方组、双抗组MMP-9 mRNA表达显著降低（P＜0.01）。与假手术组相比，心痛方组、双抗组MMP-9 mRNA表达升高（P＜0.01）。心痛方组、双抗组比较，双抗组MMP-9 mRNA表达升高（P＜0.01）。与模型组比较，心痛方组、双抗组TIMP-1 mRNA 表达显著增高（P＜0.01），且心痛方组更有优势（P＜0.01）。与假手术组相比，模型组MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA 的比值明显增高（P ＜ 0.01），TIMP-1 mRNA 的比值明显降低（P＜0.01）。与假手术组相比，心痛方组、双抗组MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的比值升高（P＜0.01）。心痛方组、双抗组比较，双抗组MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA 的比值升高（P＜0.01）。

表1 各组大鼠心肌组织MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表达比较（±s）

表1 各组大鼠心肌组织MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表达比较（±s）

与假手术组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.01；与心痛方组比较，#P＜0.01。 下同。

组别 n MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA假手术组 17 0.36±0.02模型组 13 0.93±0.01△心痛方组 15 0.45±0.01△*0.47±0.04 1.30±0.07 1.23±0.05△ 1.32±0.05 0.71±0.04△* 1.58±0.05△*双抗组 14 0.57±0.01△*#0.84±0.03△*# 1.47±0.05△*#

2.2 各组大鼠心肌组织病理形态学改变、心肌损伤程度评分及心梗面积测定 见图1，表2。如图1示，假手术组心肌纤维着色均匀，排列整齐、规则，胞界清楚，间质未见异常；模型组大鼠心肌纤维出现大量凝固性坏死并伴有重度嗜中性粒细胞点状浸润，心肌纤维水肿，肌浆疏松、淡染；心痛方组、双抗组心肌纤维坏死程度及嗜中性粒细胞点状浸润较模型组明显减轻，只有部分心肌纤维水肿。如表2示，与假手术组比较，模型组、双抗组心肌形态学评分增高（P＜0.01），心痛方组差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，心痛方组、双抗组评分明显降低（P＜0.01）；与心痛方组比较，双抗组差异无统计意义（P＞0.05）。各给药组心梗面积与模型组相比均缩小（P＜0.01），心痛方组在缩小心梗面积上较双抗组更有优势（P＜0.05）。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态学改变（HE染色，400倍）

表2 各组大鼠心肌细胞形态学改变评分及心梗面积比较（±s）

表2 各组大鼠心肌细胞形态学改变评分及心梗面积比较（±s）

组 别 n 心肌形态学评分（分） 心梗面积（%）假手术组 17 0.18±0.39模型组 13 1.69±0.48△ 35.43±1.44心痛方组 15 0.60±0.63# 22.12±0.96*双抗组 14 0.93±0.73△ 23.19±0.89#*

2.3 各组大鼠心肌MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值与心肌细胞形态学改变相关性分析 见表3。大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值与各组大鼠对应心肌形态学评分呈正直线相关（r=0.684，P=0.00）。

表3 大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值与心肌细胞形态学改变相关性分析

2.4 大鼠心肌MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值与心梗面积相关性分析 见表4。大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值与模型组、心痛方组、双抗组对应心梗面积呈正直线相关（r=0.975，P=0.00）。

表4 大鼠MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值与心梗面积相关性分析

3 讨 论

研究发现，MMPs和TIMPs共同参与了许多心血管疾病的发生发展过程，合理调控MMPs的活性与表达有利于心血管疾病的治疗。而动脉粥样硬化是公认的在几个不同疾病阶段发生的炎症反应过程，其中有许多是与MMPs的活性改变有关。正常生理情况下，MMPs/TIMPs保持动态平衡状态。血管细胞外基质成分如胶原蛋白、弹性蛋白能够被这些激活的MMPs降解，从而导致血管的老化以及动脉粥样硬化的形成［5］。MMP-9是基质金属蛋白酶家族的主要成员，也是冠心病的一个重要炎症因子，可以促进炎症细胞的渗出，并与ACS的发生发展有重要关系［6］。研究表明，ACS早期炎症活动较显著，AMI患者MMP-9水平明显升高［7］。在AMI发生后，MMP-9的活性增加，从而促进胶原蛋白的降解［8-9］。且 MMP-9 的表达与心肌受损程度相关［10］，其对AMI患者的不良预后有一定的预测价值［11-12］。而TIMP-1是MMP-9的特异性抑制物，通过与MMP-9特异性结合，能够抑制MMP-9的活性，减少MMP-9对细胞外基质的降解［13］，从而维持ECM的动态平衡。本研究发现，造模后实验组MMP-9 mRNA表达较假手术组明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，心痛方组及双抗组MMP-9 mRNA表达减少（P＜0.01），TIMP-1 mRNA表达增加（P＜0.01），提示大鼠心肌梗死后发生了MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA活性变化，心痛方组及双抗组可降低MMP-9 mRNA表达，增加TIMP-1 mRNA活性，从而调节MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的平衡。

心肌梗死属中医学“胸痹心痛”“真心痛”等范畴，其可由寒邪内侵、饮食不节、情绪失调、劳逸失节、年迈体虚等相互作用所致，病机总概括为“不荣而痛”与“不通而痛”共存，其中心络不畅或不通为其病机之基础，气血不荣为疼痛之理。其发病与痰瘀密切相关，痰瘀互结证为其常见证候，也是急性心肌梗死发病的重要病理因素。心痛方根据疏肝化瘀豁痰法立方，由柴胡、瓜蒌、川芎、桃仁、蒲黄、白芥子、郁金、九香虫、甘草组成，主治痰瘀互结气郁证胸痹心痛，化痰与祛瘀并举，冀脉络通畅，气血安和，心痛之疾可瘥，因而临床疗效确切。现代药理研究亦表明，心痛方中多味中药对于冠心病均有良好疗效，如柴胡具有抗氧化、抗血小板凝集等诸多作用［14］；川芎中酚酸类化合物具有抑制血小板聚集、抗动脉粥样硬化、清除自由基等药理活性［15］；桃仁石油醚提取物可能对心肌缺血损伤有改善作用，并对急性心肌梗死有较好的防治作用［16］；九香虫具有明显的抗凝血作用，其虫体水煎液体外可抑制家兔血小板聚集［17］。通过本研究发现，心痛方能使AMI大鼠心肌组织MMP-9 mRNA表达减少，增加TIMP-1 mRNA的表达，有效减少AMI大鼠心梗面积，使心肌损伤程度降低，提示心痛方对急性缺血缺氧后心肌具有明显保护作用。心痛方治疗AMI的作用机制之一可能是对MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA活性表达的有效调控，通过调节MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA的平衡来实现，但具体机制尚未明确，尚需进一步研究。

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Effect of Xintong Decoction on the Expression of MMP-9 mRNA and TIMP-1mRNA in Acute Myocar-dial Infarction Rats

XIE Rongyuan，FAN Jinru，ZHOU Feiran，et al. Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To investigate the effect of Xintong Decoction on the expression of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） mRNA，tissue inhibitor of metalloproteinase-1 （TIMP-1） mRNA and effects on myocardial morphology in acute myocardial infarction （AMI） rats，and to explore the therapeutic mechanism of Xintong Decoction on AMI.Methods：80 SD rats were randomly divided into sham operation group （A group），the model group（group B），Xintong Decoction group（group C），and Dual anti-platelet group （aspirin+clopidogrel，group D）.AMI model was established by coronary artery ligation method.Rats were killed 7 days after intragastric administration.Expression of MMP-9 mRNA and TIMP-1 mRNA in myocardium were observed by RT-PCR，and morphological changes were observed by HE staining.Results：Xintong Decoction could reduce the expression of MMP-9 mRNA（P ＜ 0.01），increase the expression of TIMP-1 mRNA（P＜0.01），and decrease the ratio of MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA in AMI rats（P ＜ 0.01）.The degree of myocardial injury and the area of myocardial infarction were positively correlated with MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA ratio.Conclusion：Xintong Decoction has protective effects on AMI ischemic myocardium，and its mechanism may be related to increasing the expression of TIMP-1 mRNA，reducing the expression of MMP-9 mRNA and thus regulating the balance of MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA.

Acute myocardial infarction；Xintong Decoction；MMP-9 mRNA；TIMP-1 mRNA

R285.5

A

1004-745X（2017）11-1922-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.012

湖南省教育厅科学研究项目（16A159）

△通信作者（电子邮箱：fanjr218@sina.com）

2017-08-10）