实时荧光定量聚合酶联反应在石蜡切片可疑结核病诊断中的应用

成克伦，高绍莹，陈秀婵，姜 森，马庆庆，周永松，熊云刚，邹阳强

(贵州航天医院 1．病理科；2.中心实验室，贵州 遵义 563000)

健康科学基础研究

实时荧光定量聚合酶联反应在石蜡切片可疑结核病诊断中的应用

成克伦1，高绍莹2，陈秀婵1，姜 森1，马庆庆2，周永松1，熊云刚1，邹阳强1

(贵州航天医院 1．病理科；2.中心实验室，贵州 遵义 563000)

目的探讨实时荧光定量聚合酶联反应(FQ-PCR)法检测结核分枝杆菌DNA在可疑结核病诊断中的应用价值。方法应用FQ-PCR法，对50例可疑结核病的石蜡切片进行结核分枝杆菌DNA检测。结果检出35例结核分枝杆菌DNA阳性，阳性率70.0%；结合临床、影像和检验等资料综合分析后，29例明确诊断为结核病，确诊率为58.0%。结论FQ-PCR能检出石蜡切片部分可疑结核病的结核杆菌DNA，从而确定感染病原体，有助于临床有效诊断。

实时荧光定量；聚合酶联反应；石蜡切片；结核病

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病，可累及人体各个器官，以肺结核病和淋巴结结核病多见，近年来发病率有所上升。典型结核病病理上诊断容易，当出现不典型病理改变呈可疑结核时诊断较困难。本文通过FQ-PCR法，探讨可疑结核病石蜡切片结核分枝杆菌DNA检测的可行性，为确诊结核病提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料 收集贵州航天医院2015年6月—2016年5月可疑结核病标本50例，其中肺穿刺标本29例，胸膜穿刺标本12例，肠镜活检标本3例，手术切除大标本6例(肺1例、软组织包块1例、关节滑膜2例、淋巴结1例、皮肤1例)。标本来源病例男32例，女18例，年龄25～75岁；临床诊断结核15例。

1.2 方法

1.2.1 HE切片 标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片，厚4μm，HE染色。

1.2.2 FQ-PCR检测切片准备 小标本连续切取10片，大标本切取5片，厚5μm，置于1.5mL离心管中。

1.2.3 切片DNA提取 采用石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒提取DNA，按说明书进行操作，试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.2.4 FQ-PCR检测 分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)为博奥生物集团有限公司产品，全自动医用PCR分析系统为上海宏石医疗科技有限公司产品。取出扩增反应液置于冰盒上解冻，取2μLDNA提取后的样本加入到18μL含有引物、探针和酶的扩增反应液管中进行扩增；同时设阴性和阳性对照，用试剂盒提供的对照品进行。PCR扩增程序设定：37 ℃循环1次，时间300 s；94 ℃循环1次，时间180 s；94 ℃循环40次，时间15 s；60 ℃循环40次，时间30 s；50 ℃循环1次，时间10 s。同时选择FAM和HEX通道，荧光采集点选择60 ℃、30 s。

1.2.5 结果判断 样本扩增曲线呈S型，且Ct值﹤40为阳性；扩增曲线不呈S型或Ct值为40(或无数值)为阴性。

2 结果

50例可疑结核病标本中，44例病变呈肉芽肿性炎改变，坏死组织少或无坏死组织(见图1)，FQ-PCR结核杆菌DNA阳性31例。6例病变为坏死组织，周围为纤维组织而无肉芽肿结构(见图2)，FQ-PCR结核杆菌DNA阳性4例。全部病例中，FQ-PCR结核杆菌DNA阳性总数35例，阳性率为70.0%(见表1)。阳性扩增曲线呈S型，且Ct值﹤40(见图3)，阴性扩增曲线不呈S型，或Ct值为40(或无数值)(见图4)。结合临床、影像和检验等资料综合分析后，29例明确诊断为结核病，确诊率为58.0%。

图1 可疑结核病的肉芽肿性炎 HE×100

图2 可疑结核病的坏死组织 HE×200

标本类型nCt值无数值40﹤40FQ-PCR-+肺穿刺293422722胸膜穿刺1222848手术切除611424肠镜活检320121合计5087351535

图3 结核杆菌DNA阳性扩增曲线(FAM/HEX)

图4 结核杆菌DNA阴性扩增线(FAM/HEX)

3 讨论

世界卫生组织(WHO)新出版的《2015年全球结核病报告》中显示：2014年全球新发病人数为960/万，我国为94/万；患病率全球为174/10万，我国为89/10万；发病率全球为133/10万，我国为68/10万；全年有150万人死于结核病[1]。因此，目前结核病的诊治仍刻不容缓。结核分枝杆菌为结核病病原菌，是一种生长缓慢，抗酸染色阳性的棒状杆菌。它可侵犯全身各器官，引发多系统结核病，以肺结核最为多见。结核病的基本病理变化为渗出、增生和坏死，这三种病变往往同时存在而以某一种病变为主[2]。在病理切片上最有诊断价值的是结核结节，典型结核结节中心为干酪样坏死物即坏死彻底的凝固性坏死，周围为类上皮细胞和数量不等的朗汉斯巨细胞，外围可有淋巴细胞和成纤维细胞。具有典型结核结节的病变病理诊断不难，但当病变不典型即可疑结核时病理上很难确诊，这些可疑结核病变一种呈肉芽肿性炎改变，无或少有坏死，需要与结节病、异物肉芽肿、麻风和克罗恩病等多种可以呈肉芽肿改变的疾病鉴别。另一种为只有坏死组织，但无法判断为干酪样坏死，周围为纤维组织无肉芽肿组织，需要与其它炎症或肿瘤引起的坏死鉴别。另外，由于内窥镜和穿刺应用越来越广泛，所取标本少有时不一定能反映病变全貌，可疑结核小标本量在不断增多，也给诊断提出了更高要求。这种情况下，应用一种什么方法来快速准确帮助诊断和鉴别结核病，是许多病理工作者关心的问题。传统方法是对切片进行抗酸染色，但福尔马林固定的组织会使蛋白产生交联，加之一些脱水剂的作用，可能会影响结核分枝杆菌的阳性染色[3]，导致阳性率很低。研究[4]表明，FQ-PCR技术具有准确性高、重复性好等特点，已广泛用于基因表达、病原体检测等诸多研究领域，并被成功用于微生物快速定量检测。在结核杆菌的检测中，阳性率高于其它方法[5]，本实验就是基于FQ-PCR技术来提高切片可疑结核的确诊而进行的。

本研究中，对50例病理切片可疑结核标本应用FQ-PCR进行了结核菌DNA检测，35例阳性，阳性率为70%。结合临床、影像和检验等资料综合分析后，29例可明确诊断为结核病，确诊率为58%，高于文献报道[6]，可能与标本类型的选择有关。检测结果从而正确指导临床及时治疗，避免因误诊而造成结核病继续存在和发展，表明该检测方法具有实用价值，可部分弥补病理形态学诊断的不足，提高结核病的检出率，在目前缺乏更有效的鉴别方法下，本法不失为一种有效而可靠的方法，具有推广意义。FQ-PCR阳性的病例首先应该考虑结核病，但部分阳性者也可能既往患过结核病或为正常带菌者[7]，因此需要结合全面资料进行综合分析，本组有6例阳性患者，但缺乏特异性临床表现、影像学表现和实验室检测异常，单凭FQ-PCR结果，还不能完全确诊为结核，视为不确定性病例，需要随诊观察。

FQ-PCR结核杆菌DNA检测也存在假阳性和假阴性，可能与以下因素有关[8]：(1)PCR反应本身敏感性很高，有出现假阳性可能；(2)既往结核病痊愈后残留有死亡的结核杆菌或处于带菌状态，出现假阳性；(3)标本局限，未取到结核杆菌感染组织，出现假阴性；(4)标本太少，操作过程中有丢失，出现假阴性。为提高检测的准确性，在操作过程中我们体会到要注意几点：(1)穿刺和内窥镜等小标本至少切片10片以上，多个标本时切片要防止污染；(2)每次均设阳性和阴性对照；(3)DNA提取严格按规定时间和步骤进行，保证脱蜡干净，获取更多DNA；(4)PCR扩增条件按试剂盒要求设定。实验中还发现，无坏死或坏死很少的切片，阳性率较低，这可能与增生病变中结核杆菌相对较少有关。

应用FQ-PCR对结核杆菌DNA进行检测，由于使用的试剂和仪器不同，检出率存在差异，故这项检测有待于进一步的创新优化和标准化，保证结果的准确性和客观性，提高结核病病原体检出率以更好地帮助确诊。

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Applicationofreal-timeFQ-PCRinthediagnosisofthesuspectedtuberculosisinparaffinsection

CHENG Ke-lun1，GAO Shao-ying2，CHEN Xiu-chan1，JIANG Sen1，MA Qing-qing2，ZHOU Yong-song1，XIONG Yun-gang1，ZOU Yang-qiang1

(1.DepartmentofPathology；2.LabCenter，GuizhouAerospaceHospital，Zunyi563000，China)

ObjectiveTo evaluate the efficacy of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) for the detection of tubercle bacillus (TB) DNA in the diagnosis of suspected tuberculosis.MethodTB DNAs in 50 paraffin sections with suspected tuberculosis were detected by using FQ-PCR.Results35 cases were detected to be TB DNA positive, with a positive rate of 70%. Combined with clinical, imaging, and laboratory data, 29 cases were diagnosed as tuberculosis, with a diagnosis rate of 58%.ConclusionFQ-PCR can be used to partially detect TB DNAs in suspected cases, thereby to determine the infectious pathogens and finalize diagnosis of the disease, which can provide an effective method for clinical examination.

real-time fluorescent quantitative；polymerase chain reaction；paraffin section； tuberculosis

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.05.009

2017-01-10

成克伦(1964 - )，男，贵州桐梓人，本科，主任医师。

R521

A

1674-6449(2017)05-0507-03