宝藿苷I减轻急性神经炎症所致的大鼠海马神经元损伤

邓媛媛，高 虎，石琬岚，李 菲

(遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

宝藿苷I减轻急性神经炎症所致的大鼠海马神经元损伤

邓媛媛，高 虎，石琬岚，李 菲

(遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

目的考察宝藿苷I(BHG I)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性神经炎症的作用及机制。方法雄性SD大鼠随机分为假手术对照组、模型组、BHG I给药组。给药组灌胃给予BHG 130 mg/(kg·d)，其余两组灌胃给予等体积的生理盐水。预防性给药5天后，模型组及给药组左侧脑室注射5 μL脂多糖(1 μg/μL)制备急性神经炎症大鼠模型，假手术对照组同法注射等体积生理盐水。造模后24h取材，HE染色观察大鼠海马CA1区神经元结构及形态，透射电镜观察大鼠海马CA1区神经元超微结构，Real time RT-PCR测定大鼠海马组织中的环氧合酶-2(COX-2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达水平，Western blot实验检测炎症相关蛋白肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β的表达。结果BHG I预防性给药可减轻侧脑室注射LPS引起的神经元排列紊乱、CA1区嗜酸性神经元变性、核固缩以及神经元的超微结构损伤；降低炎症因子COX-2、IL-1β、iNOS的mRNA 及TNF-β、IL-1β的蛋白过度表达。结论预防性给予BHG I能拮抗LPS诱导急性神经炎症从而减少神经元损伤，其机制与抑制海马组织中炎症因子的mRNA和蛋白过度表达有关。

宝藿苷I；脂多糖；炎症；大鼠

中枢神经系统炎症是神经退行性变的关键因素之一。在诸如帕金森氏病、阿尔茨海默病、多发硬化症、血管性痴呆等多种中枢神经退行性疾病中均已证实神经炎症扮演了关键角色[1-3]。神经炎症发生过程中，小胶质细胞和星形胶质细胞被大量激活，释放炎症介质，从而产生细胞毒性反应，引起自由基形成、氧化应激反应及神经元损伤，最终导致神经元退行性变、凋亡及最终死亡[4]。

宝藿苷I(Baohuoside I,BHG I)，又名淫羊藿次苷Ⅱ(icariside Ⅱ)，是中药淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim)的有效成分之一，分子式C27H30O10，相对分子质量为514.53。BHG I药理作用广泛，包括抗神经元损伤、抗肿瘤、抗骨质疏松、改善心血管功能、提高性功能等[5-7]。此外，药动学研究发现，BHG I是淫羊藿另一有效成分淫羊藿苷在脑内的主要代谢产物[8-10]。本课题组在前期研究中发现淫羊藿苷对多种中枢神经系统疾病具有积极作用，可对抗长期染铝或海马内注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所诱导的大鼠痴呆，以及对自然衰老性痴呆模型的保护作用等[11-12]。然而，BHG I是否通过改善神经炎症而缓解中枢退行性疾病，尚不清楚。因此，本研究拟通过大鼠侧脑室注射LPS诱导急性神经炎症模型，考察BHG I预防性给药是否对急性神经炎症有拮抗作用，并探索其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠60只，体重250～350 g，由重庆第三军医大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(渝)2013-0005。适应性饲养7 d。

1.1.2 主要药品和试剂 BHG I(经HPLC检测，纯度gt;98%)购自南京泽郎医药有限公司；脂多糖购自美国Sigma公司；逆转录试剂购自宝生物工程有限公司；COX-2、IL-1β、iNOS及GADPH基因的引物序列从GenBank查询并由上海生工生物工程有限公司合成，相关基因的引物序列(见表1)。

表1各基因的引物序列

基因基因库入口上游引物下游引物COX-2NM_017232.3AACACGGACTTGCTCACTTTGTTGAATGGAGGCCTTTGCCACTGIL-1βNM_031512.2GCTGTGGCAGCTACCTATGTCTTGAGGTCGTCATCATCCCACGAGINOSNM_012611.3CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTAGGGTCTTCGGGCTTCAGGTTAGAPDHNM_017008CAGTGCCAGCCTCGTCTCATAACCAGGCGTCCGATACG

1.1.3 主要仪器 RNA逆转录仪(Eppend of Mastercycler Gradient PCR)购于德国Eppendorf公司；PCR热循环仪(iCycler iQ)购置于美国Bio-Rad公司；电子分析天平(BS-110S)购置于北京赛多利斯天平有限公司；大鼠脑立体定位仪(SR-6N)购置于日本东京Setagaya.ku公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药 随机法分为3组，分别为假手术对照组(sham，n=20)，模型组(LPS，n=20)，治疗组(LPS+BHG I，n=20)。分组后次日开始给药，治疗组灌胃BHG I 30 mg/kg/d，假手术组和模型组灌胃等体积的生理盐水(normal saline,NS)。

1.2.2 造模 预防性给药5 d后进行手术造模。大鼠经7%水合氯醛麻醉后，固定在脑立体定位仪上，剪毛、消毒，沿头部正中切口(1.0 cm)，暴露前囟及正中线。侧脑室进针坐标为：AP-0.8 mm(前囟后)、ML-1.5 mm(中线左侧)、H-3.8 mm(脑膜下深度)。定位后钻开颅骨，微量注射器垂直进针，模型组、治疗组注射5 μl浓度为1 μg/μL的LPS溶液。假手术组同法注射等体积NS。术后伤口外用红霉素软膏涂抹预防感染。

1.2.3 海马组织形态学观察 每组随机取5只大鼠，经7%水合氯醛麻醉后，仰卧固定，4%多聚甲醛(PBS稀释)透灌，断头取脑，固定后常规石蜡包埋，冠状切片为厚度5 μm 脑片，参考课题组既往报导行HE染色法染色[13]。每组另取5只大鼠用于透射电镜观察，同前法透灌后断头取脑，分离海马，用刀片将其切成匀称的小块后转移至预冷的戊二醛电镜固定液中。固定，丙酮梯度脱水，包埋，超薄切片(50～70 nm)；醋酸铀、硝酸铅双重染色后用透射电镜观察神经元超微结构。

1.2.4 Real time RT-PCR检测COX-2、IL-1β和iNOS的mRNA表达 各组剩余大鼠麻醉后，断头取脑并快速分离海马，将左侧海马组织置于盛有总RNA抽提试剂(Trizol)的EP管中，提取海马总RNA，测定浓度。逆转录体系为10 μL，依次为5×Primescript buffer 2 μL、Prime RT Enzyme Mix 0.5 μL、Oligod T Primre 0.5 μL、Random 6 mers 0.5 μL、Total RNA 0.5 μg/CRNA、DEPC 水 6.5 - 0.5 μg / CRNA。经RNA逆转录仪逆转录后获得cDNA，按10 μL RT-PCR 体系配置后进行扩增，SYBR green 5 μL、上下游引物 0.5 μL、DEPC 水 2.5 μL、cDNA 2 μL。反应步骤为第一步：95 ℃×8.5 min， 第二步：95 ℃ ×15 s，58 ℃×1 min，循环45 次。目的基因表达水平的相对定量法同课题组既往报导[14]，即① Ct average=(Ct1+Ct2)/2 (复孔)；②dCt值=Ct average-中间值；③目的基因的表达=2-dCt；④相对基因的表达=目的基因的表达/内参基因的表达(对照设为100)。

1.2.5 Western blot实验 提取右侧海马总蛋白并计算蛋白浓度。将样品制备后上样至8% SDS-PAGE 凝胶梳孔，电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育后，ECL发光显影，凝胶成像系统和Quantity One定量分析系统对结果进行半定量分析。

2 结果

2.1 BHG I对大鼠海马组织CA1区神经元形态的影响 HE染色观察大鼠海马组织CA1区神经元形态，结果显示，假手术组大鼠海马CA1区神经元形态正常、排列整齐；模型组大鼠海马CA1区细胞排列紊乱，神经元嗜酸性变性，核固缩。与模型组比较，BHG I预防性给药组海马CA1区神经元排列较为规整，仅见少量变性(见图1)。

A、D:假手术组；B、E:模型组；C、F:BHG I治疗组。图1 HE染色观察BHG I对大鼠海马组织CA1区神经元形态的影响

2.2 BHG I对炎症相关基因mRNA表达水平的影响 Real time RT-PCR检测炎症相关基因IL-1β、COX-2、iNOS的表达。结果发现，与假手术组比较，模型组大鼠海马的IL-1β、COX-2、iNOS的mRNA表达水平明显增高(Plt;0.05)，其均值分别为假手术对照组的9.4、2.2、13.7倍；而与模型组比较，BHG I治疗组大鼠海马的上述基因mRNA表达显著下降(Plt;0.05)(见图2)。

2.3 BHG I对大鼠海马组织CA1区神经元超微结构的影响 使用透射电子显微镜观察各组大鼠海马CA1区神经元的超微结构，结果如图3所示：假手术组大鼠海马CA1区神经元胞核形态规则，染色质分布均匀(如图3A箭头所示)，线粒体及内

*表示与假手术组比较，Plt;0.05；#表示与模型组比较，Plt;0.05。 图2 BHG I对大鼠海马的IL-1β、COX-2、iNOS mRNA表达水平的影响

质网结构清晰；模型组大鼠海马CA1区神经元超微结构受损，异染色质聚集(图3B箭头所示)，核周间隙明显增宽，线粒体出现肿胀(图3E中箭头所示)；与模型组比较，治疗组CA1区神经元超微结构损伤明显减轻，线粒体及内质网结构清晰。

A、D:假手术组；B、C:模型组；C、F:BHG I治疗组。(A、B、C图箭头所指为胞核内染色质及核周间隙，D、F箭头所指为内质网和线粒体，E图箭头所指分别为线粒体和胞核内异染色质)。图3 透射电镜观察BHG I对大鼠海马CA1区神经元超微结构的影响

2.4 BHG I对炎症相关蛋白表达水平的影响 通过Western blot实验检测大鼠海马组织中IL-1β和TNF-α蛋白表达。结果发现(见图4)，模型组海马组织中IL-1β和TNF-α的蛋白表达较假手术组明显升高(Plt;0.01)，而预防性给予BHG I后，大鼠海马的IL-1β和TNF-α表达较模型组显著下降(Plt;0.05)。

*表示与假手术组比较，Plt;0.05；#表示与模型组比较，Plt;0.05。图4 BHG I对大鼠海马的IL-1β和TNF-α蛋白表达水平的影响

3 讨论

中枢炎症反应在神经退行性疾病中起到重要作用。神经炎症发生时小胶质细胞和星形胶质细胞被激活，伴随大量促炎症因子如细胞因子、粘附因子等的释放，从而产生细胞毒性，导致神经元损伤、变性死亡[15-16]。LPS作为一种细菌内毒素，经侧脑室注射后，可诱导小胶质细胞、星形胶质细胞等炎症细胞被大量激活，释放IL-1β、COX-2等炎症反应介质，在24 h内使炎症反应达到峰值，常被用于诱导急性炎症动物模型[17-19]。因此本研究采用BHG I预防性给药5 d后，LPS侧脑室注射诱导急性神经炎症模型观察BHG I对模型大鼠的作用及机制。结果发现侧脑室注射LPS 24 h后，大鼠的海马结构被破坏，海马CA1区神经元嗜酸性变性，且神经元超微结构明显受损，炎症因子IL-1β、COX-2、iNOS的mRNA表达水平及IL-1β和TNF-α的蛋白表达明显上调，表明侧脑室注射LPS诱导了大鼠急性神经炎症模型。

BHG I为贵州省道地中药材淫羊藿的主要成分，本课题组长期致力于淫羊藿药理活性的研究。在宝藿苷I对链脲佐菌素所致的大鼠学习记忆减退模型中我们发现，宝藿苷I 3 mg/kg和10 mg/kg连续给药21 d，仅10 mg/kg 宝藿苷I对模型大鼠显示出治疗作用[20]；在宝藿苷I对脑缺血再灌注损伤大鼠的作用研究中，我们则进一步发现预防性给予宝藿苷I 30 mg/kg，其疗效明显优于宝藿苷I 10 mg/kg剂量[21]。因此，在本实验中，采用30 mg/(kg·d)这一最佳给药剂量，观察BHG I对急性神经炎症的保护作用。通过细胞形态学检测，发现BHG I预防性给药明显减轻了LPS导致的海马CA1区神经元排列紊乱，变性以及超微结构的改变，缓解LPS诱导的神经元损伤。

为进一步探索BHG I改善LPS诱导的神经元损伤的作用机制，考察了BHG I对大鼠海马组织中炎症因子的mRNA及蛋白表达的影响。COX-2是炎症级联反应中的主要介质，可生成具有高效促炎介质的前列腺素,激活小胶质细胞形成炎症环路[22-23]。IL-1β是一种促炎细胞因子，主要以以分泌形式发挥活性，其分泌型表达升高时，会抑制小胶质细胞的吞噬作用，加重炎症反应[24]。TNF-α是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，存在无活性前体和分泌型两种形式，其活性形式通常由巨噬细胞分泌产生，作为一种内源性致热源，能够诱发并加重炎症反应。iNOS是催化一氧化氮产生的反应酶，其产物一氧化氮作为自由基产生神经毒性的同时也参与炎症反应过程[25]。在我们的研究中发现，侧脑室注射LPS后，大鼠海马组织中的COX-2、IL-1β、iNOS的mRNA表达水平明显增高，同时，我们检测了分泌型活性IL-1β和TNF-α片段，发现IL-1β和TNF-α的蛋白表达显著上调，而BHG I能明显降低上述基因和蛋白的表达。提示BHG I预防性给药可抑制海马组织中炎症因子的mRNA和蛋白过度表达。

综上所述，本实验证实BHG I可改善LPS诱导的急性神经炎性反应，缓解神经元损伤变性，其潜在机制与降低海马组织中COX-2、IL-1β、iNOS的mRNA表达及IL-1β和TNF-α的蛋白表达有关。同时，在下一步的工作中，我们将进一步采用免疫组化，Western blot 等方法检测小胶质细胞激活标志物及相关信号通路的变化，深入研究BHG I的作用机制，以期为BHG I的应用提供更全面的药理学依据。

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[收稿2017-06-24;修回2017-08-17]

(编辑：谭秀荣)

基础医学研究

BaohuosideIattenuateshippocampalneuronaldamageinducedbyacuteneuroinflammationinrats

DengYuanyuan,GaoHu,ShiWanlan,LiFei

(Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo explore the effects of Baohuoside I (BHG I) on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute neuroinflammation in rats and its possible mechanisms.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (sham),model group and BHG I treated group.The treatment group was administered BHG I by gavage at the dose of 30 mg/kg once per day,sham group and model group was given an equal volume of saline.Five days after pretreatment with BHG I or saline,rats were anesthetized with chloral hydrate and secured in a stereotaxic apparatus.LPS (5 μg in 5 μL steriled in saline) was injected into left intracerebroventricular into the model and BHG I treated groups.The sham group underwent all surgical steps,with the exception that saline was administered rather than LPS.Animals were sacrificed 24 hours after the surgery,brain tissues were collected quickly for HE staining,transmission electron microscopy,real time RT-PCR analysis and western blot assay.ResultsBHG I administration significantly attenuated LPS-induced neuron disorders,CA1 region eosinophilic neuronal degeneration,karyopycnosis neurons and ultrastructural damage.meanwhile,BHG I reduced the over-expression of COX-2,IL-1β,iNOS mRNA and TNF-α,IL-1β protein in the hippocampus.ConclusionBHG I has a protective effect on LPS-induced acute neuroinflammation in rats.The mechanisms are due to the inhibition of the mRNA and protein expression of inflammatory factors.

Baohuoside I; lipopolysaccharide; inflammation; rat

贵州省科技厅联合资金项目(NO：黔科合LH字[2015]7533)；贵州省卫生计生委科学技术基金项目(NO：gzwjkj2014-1-069)；遵义市科技局遵义医学院联合资金项目(NO：遵市科合社字[2016]29)。

李菲，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：神经药理学，E-mail:lifei@zmc.edu.cn。

R965

A

1000-2715(2017)05-0516-06