“动物组织中DNA的分离提取及含量测定”实验教学改革

赵玉红， 李 欣， 李小菊， 周 浩， 李登文， 石建党， 张金红， 赵立青

(南开大学 生物实验教学中心， 天津 300071)

“动物组织中DNA的分离提取及含量测定”实验教学改革

赵玉红， 李 欣， 李小菊， 周 浩， 李登文， 石建党， 张金红， 赵立青

(南开大学 生物实验教学中心， 天津 300071)

对经典生物化学实验项目“动物组织中DNA的分离提取及含量测定”实验进行改革。在传统浓盐法提取基因组DNA、二苯胺法检测DNA含量的实验基础上，新增试剂盒方法提取DNA以及超微量分光光度计检测DNA两大现代实验技术内容，对经典实验进行拓展、升级。此外，针对实验中比色杯污染影响检测结果精密度和准确性的困扰难题，提出2种简便易行的清洗方法，提高实验数据的真实性和有效性。

实验教学改革； DNA提取； DNA检测

DNA的分离提取是分子生物学研究最基础的技术，DNA的提取质量直接影响到PCR扩增基因片段、限制性酶切分析以及基因测序等下游实验的成败[1]。“动物组织中DNA的分离提取及含量测定”是目前国内高校普遍开设的经典生物化学实验项目，在保留原有浓盐法提取基因组DNA、二苯胺法检测DNA含量的基础上，新增目前广泛使用的商品化试剂盒进行DNA的提取、采用超微量分光光度计检测DNA的实验内容。此外，针对实验中比色杯污染严重影响检测结果精密度和准确性的难题，经反复实验探索，提出2种简便易行的清洗解决方法。

1 实验教学改革

“动物组织中DNA的分离提取及含量测定”实验在传统教学中存在几大问题：

(1) 实验项目独立开设，学生的思维仅局限于本实验原理和技术的掌握，缺少对相关知识联系和技术整合的意识和能力；

(2) DNA提取及含量检测技术发展迅速，而传统教学中采用的实验技术、手段相对落后，学生的学习积极主动性不高；

(3) 实验数据多为“正结果”，学生缺少反思的“原动力”，不利于学生发现问题、分析问题和解决问题能力的培养；

(4) DNA与二苯胺反应产生的蓝色不易退色，极易造成比色皿的污染，严重影响实验检测结果的精密度和准确性，不利于学生对实验结果作出科学的分析。

这些问题严重影响了实验教学效果，亟须改革。

1.1 实验内容的拓展、升级

(1) 基因组DNA的提取。分别采用浓盐法(根据参考书《生物化学习题及实验技术》[2])、试剂盒法(参照Solarbio动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明书)2种方法，提取动物肝脏组织中的基因组DNA。

(2) DNA浓度检测。①采用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测浓盐法和试剂盒法2种提取方法获得的DNA样品浓度，计算DNA的提取率。此外，根据A260/A280的比值，还可以判断提取DNA的纯度。②利用二苯胺法检测DNA含量，根据标准曲线，计算DNA的提取率。

1.2 比色杯清洗方法的改进

DNA在酸性条件下加热，可与二苯胺反应生成一种蓝色的复合物，595 nm波长下具有强烈的吸收。在一定浓度范围内，所成颜色的深浅与DNA的量之间有线性关系，可采用比色法测定样品中DNA的含量，这是目前许多高校本科生物化学实验教学中检测DNA含量常用的经典二苯胺法。但是，DNA与二苯胺产生的蓝色不易退色，极易造成比色皿的污染，导致严重影响实验检测结果的精密度和准确性，以及大大降低比色杯的重复利用率，给正常的实验教学带来很大的困扰。为有效解决DNA与二苯胺反应物所污染比色杯的清洗难题，提高实验数据的真实性和有效性，提出2种简便易行的清洗方法。

(1) 新使用比色杯的清洗。①盛放DNA与二苯胺反应物的比色杯使用完毕后，立即清水冲洗；②放在盛有双氧水的器皿中浸泡至少1小时；③依次用清水、蒸馏水冲洗干净，自然晾干。

(2) 已污染比色杯的清洗。①用双氧水和氨水，以1∶1的比例，反复浸泡3～4次，浸泡时间以双氧水和氨水反应完毕为准；②污染严重的，用双氧水和氨水浸泡3～4次以后，用双氧水浸泡3～4天，继续用双氧水和氨水(比例1∶1)浸泡至污染完全消逝；③依次用清水、蒸馏水冲洗干净，自然晾干。

2 教学改革探讨

2.1 合理构建实验内容

虽然浓盐法提取DNA技术手段上相对传统，而二苯胺法检测DNA含量灵敏度不高，两者目前在科研实践中都应用较少，但是建议保留这2部分传统的实验教学内容，理由如下：

(1) 试剂盒法提取DNA虽然简便、快速，提取的DNA纯度高、应用广泛，但是就实验教学效果而言，有待商榷。因为受专利保护等因素，试剂盒中的许多试剂仅以溶液A、溶液B、漂洗液、洗脱液等字眼来标记，并不给出每种试剂的具体成分。对于学生来讲，试剂盒方法对于实验原理、研究思路的掌握收效甚微，即使教师指出每种溶液可能的成分及其作用，但是在具体实验过程中学生关注的重点更多的是操作，不利于学生对原理知识以及研究思路的掌握。而浓盐法提取DNA对于学生掌握DNA提取的基本原理和基本研究思路非常有“教科书”意义，因此很有必要保留这一经典、传统实验教学内容。

(2) 二苯胺法检测DNA含量的实质是利用了标准曲线的方法，而标准曲线法是一种简便、快速的定量分析方法。很多生物学实验中均需要绘制标准曲线[3]，譬如酶联免疫法检测黄曲霉毒素B1的标准曲线拟合分析[4]、CYP4F2和β—action基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建[5]、构建cRNA为标准曲线定量检测柑橘碎叶病毒的方法[6]、柱前衍生RP-HPLC法测定狗尾草种子氨基酸含量[7]等都是标准曲线法在生命科学研究中的具体应用。因此有必要保留二苯胺法检测DNA含量的实验，培养学生熟练掌握标准曲线法这一重要的基本科研方法。

考虑到基础课的课时限制并结合实验课目标，可以在保留原有浓盐法提取基因组DNA、二苯胺法检测DNA含量的基础上，新增目前广泛使用的商品化试剂盒进行DNA的提取，采用超微量分光光度计检测DNA的实验内容，这是对本实验进行创新改革的最佳方案。

改革后的实验教学体现学科发展前沿，内容更为丰富，涉及的实验技能更多。学生通过课程学习，能够深入理解、掌握并运用DNA提取及含量测定的相关理论和技术，能够分析和处理实际问题[8]。

2.2 实验结果与分析

实验结果与分析是科研工作中最重要的一个环节，但许多学生往往重结果而轻分析，通常，数据不好就罗列出一系列可能的操作失误，至于哪一个起决定性作用、是如何影响数据结果的、理论上为何如此，一概不想[9]。为加强学生实验结果与分析能力培养，锻炼学生对实验结果作出更有针对性地、深入地分析讨论，充分利用改革后的实验教学优势进行适当引导，要求学生在实验报告中包含、体现以下2大实验结果与分析的内容：

(1) 浓盐法和试剂盒法2种方法提取的基因组DNA效果比较。设计表格见表1(空白表)，对浓盐法和试剂盒法2种方法提取的基因组DNA效果进行比较，并总结2种提取方法的优缺点。

表1 浓盐法和试剂盒法2种方法提取的基因组DNA效果比较

(2) 超微量分光光度计和二苯胺法检测DNA质量的效果比较。设计几个问题：超微量分光光度计和二苯胺法检测DNA含量的结果是否一致？导致检测结果不一致的因素可能有哪些？2种检测方法各有什么优缺点？影响DNA提取质量的因素有哪些？如何对DNA进行纯度鉴定？

2.3 课程组织

(1) 尊重和满足不同学生的学习需求，新增内容为选修部分。学生可自主选择做，还是不做，选择结果提前2周告知教师，方便实验准备。

(2) 按照教学计划，本实验为8学时。为了在尽量不增加课时的情况下实现实验内容的拓展，采取了充分利用实验间隙穿插进行实验的策略。首先采用试剂盒方法提取基因组DNA，在用酶消化的近2 h里，用浓盐法进行DNA的制备，此后由学生按照进度来自主安排实验；其次DNA提取完毕后，学生先用二苯胺法检测浓盐法提取的DNA含量，再用超微量分光光度计检测2种方法提取的DNA浓度和纯度。

3 改革成效

相比于传统的实验教学，改革后的实验教学取得了良好的教学效果。

3.1 引入对比教学法，提高教学效果

(1) 将浓盐法与试剂盒法2种方法提取的基因组DNA效果以及二苯胺法与超微量分光光度法2种方法测得的DNA数据结果进行关联和比较，要得到科学、可靠的结论需要学生查阅数量不少的相关文献资料，有利于引导学生跳出课本思维，促进学生多角度、深入地思考问题，并有助于培养学生在不同知识的关联和比较中发现问题、分析问题和解决问题的能力。

(2) 不同物种、不同材料的DNA提取方法不一样[10]，通过对比学习，学生对于实验原理掌握得更为透彻，对于不同提取方法提取的DNA浓度、纯度、稳定性及其影响因素等方面有了更为清晰的认识，并形成举一反三、融会贯通的科学思维方式，为今后从事科研工作奠定坚实的基础。

(3)以往实验教学中，学生只要按部就班，操作上即使不是非常规范也会得到“正结果”。而改革后，通过对2种提取方法所得结果进行对比分析，学生会深刻意识到规范操作是影响实验结果的重要因素之一，进而树立进一步规范操作的意识。

3.2 教学联系科研，激发学生学习兴趣

以往DNA提取结束后，即用二苯胺法检测DNA含量，实验相对孤立，学生大多认为只要提取到DNA即可，至于提取的纯度和浓度如何无关紧要，因而实验的积极性不是很高。但是改革后，利用超微量分光光度计，不仅可以检测DNA含量，还可以鉴定DNA的纯度，一个相对孤立的实验转化成了生物化学与分子生物学实验之间的衔接桥梁。DNA的提取质量对于分子生物学实验结果具有重要影响[7，11-12]，学生的实验结果不再是微不足道，而是变得非常有意义，这大大激发了学生的学习热情。此外，改革后采用了试剂盒、超微量分光光度计等与科研实际接轨的实验技术、手段，学生参与的兴趣明显提高。

3.3拓展和延伸内容单薄、孤立的实验项目

改革后的实验教学具有更多的“点”，譬如：①浓盐法和试剂盒法提取DNA的原理各是什么？分别有什么优缺点？②二苯胺法和超微量分光光度计检测DNA含量的结果是否一致？导致检测结果不一致的因素可能有哪些？2种检测方法各有什么优劣？③2种提取方法中，影响DNA提取纯度的因素各有哪些？学生通过对这些“点”进行剖析，对“点-点”间的相关知识进行整合、类比和归纳，利于以点带面构建起丰富的知识体系。

3.4 比色杯清洗

对比色杯，尤其是已污染比色杯的清洗(见图1)，有效解决了因DNA与二苯胺反应物污染所造成的测量误差，提高了实验数据的真实性、有效性，有助于学生对实验结果的合理性进行分析，提高教学效果。

图1 已污染比色杯的清洗

4 结语

“动物组织中DNA的分离提取及含量测定”实验教学改革，在生物伯苓班小班授课中已成功运行2轮，教学效果良好，目前正在向普通班推广实施。改革后的实验教学优势主要体现在：(1) 理论联系实际，有利于学生加深理论知识的理解和学以致用；

(2) 引入生物化学新技术、新方法，有利于学生了解学科前沿；

(3) 以人为本，尊重和满足不同学生的学习需求。

改革后的实验课整体教学水平得到显著提升，更有利于学生科研能力和综合素养的培养。

References)

[1] 王丹，邓春青，赵龙凤.两种外周血 DNA提取方法的比较[J].现代生物医学进展，2015，15(6):1138-1140.

[2] 于自然，黄熙泰，李翠风.生物化学习题及实验技术[M].北京:化学工业出版社，2003:258-261.

[3] 赵永攀，石磊，李晋,等.CYP4F2 和 β-actin 基因实时荧光定量 PCR标准品质粒和标准曲线的构建[J].2016，26(1):98-100.

[4] 刘科宏，宋震，李中安,等.构建cRNA为标准曲线定量检测柑橘碎叶病毒的方法[G]//中国植物病理学会2012年学术年会论文集.2012:240-243.

[5] 赵岩，唐国胜，侯莹莹,等. 柱前衍生RP-HPLC法测定狗尾草种子氨基酸含量[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)：2015，43(9):185-189.

[6] 李莉，张英，李占军,等.将克隆猪先进技术应用于本科实验教学中[J].实验室研究与探索，2014，33(10):222-224.

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[9] 郭婷，孟涛，方伊,等.理论 实践与科研三位一体物理化学实验教学改革[J].实验室研究与探索，2015，34(5):138-140.

[10] 徐宗昌，王萌，孔英珍.烟草碱法提取基因组 DNA 的改进[J].生物技术通报，2017，33(2):59-65.

[11] 吕晓岩，肖苒.一种提取全血基因组DNA的改良方法[J].生物技术通讯，2015，26(6)：852-853.

[12] 田春艳，李富生，何丽莲,等.割手密叶绿体DNA的高效提取方法[J].分子植物育种，2016,14(1):86-91.

Experimental teaching reform on “Isolation, Extraction and Content Determination of DNA in Animal Tissues”

Zhao Yuhong, Li Xin, Li Xiaoju, Zhou Hao, Li Dengwen, Shi Jiandang, Zhang Jinhong, Zhao Liqing

(Biological Experimental Teaching Center， Nankai University， Tianjin 300071， China)

The reform is carried out on the classical biochemical experiment, i.e., Isolation, Extraction and Content Determination of DNA in Animal Tissues. On the basis of the traditional concentrated salt method of extracting genomic DNA and the diphenylamine method of detecting the DNA content, the two major modern experimental technical contents are newly added, i.e., the reagent kit method is used to extract DNA and the ultra micro spectrophotometer is used to detect DNA, which has expanded and upgraded the classical experiment. In addition, in view of the problem in the experiment that the colorimetric cup contamination affects the precision and accuracy of the detection results, two simple and convenient cleaning methods are put forward to improve the authenticity and validity of the experimental data.

experimental teaching reform; DNA extraction; DNA detection

10.16791/j.cnki.sjg.2017.11.053

Q5-33；G642.423

A

1002-4956(2017)11-0214-03

2017-04-11

国家基础学科人才培养基金“条件建设项目”(J1310003)；南开大学2014年教学改革项目

赵玉红(1981—)，女，山东青岛，硕士，实验师，从事生物化学和分子生物学实验教学工作

E-mailzyh@mail.nankai.edu.cn

赵立青(1962—)，女，云南洱源，博士，教授，从事蛋白质结构与功能研究以及基于蛋白质结构的工程应用.

E-maillqzhao@nankai.edu.cn