纳米级兔骨粉球磨法制备工艺优化

李少博，李洪军※,2，贺稚非,2

（1. 西南大学食品科学学院，重庆 400716；2. 重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716）

纳米级兔骨粉球磨法制备工艺优化

李少博1，李洪军※1,2，贺稚非1,2

（1. 西南大学食品科学学院，重庆 400716；2. 重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716）

为了探索兔骨精深加工的新方法，提高兔骨的利用率和附加值，该文以70日龄伊拉兔的脊骨、肋骨和腿骨为试验原料（其中脊骨和肋骨的总质量与腿骨的质量比为 4∶1），经高压蒸煮、蛋白酶酶解、胶体磨研磨、真空冷冻干燥、标准筛过筛、球磨机球磨等处理，采用动态光散射的方法对兔骨粉的平均粒径和分布系数（PDI，particle dispersion index）进行测量，在单因素试验的基础上，用响应面法优化球磨法制备纳米级兔骨粉的工艺参数，并建立二次回归方程。最终得到球磨法的最佳制备工艺为：球磨转速558 r/min，球磨时间4.7 h，球料比为3.66∶1，在此条件下进行3次验证试验，得出兔骨粉的平均粒径为（502.5±11.7）nm，PDI为0.497±0.021，与预测值的相对误差均低于5%，表明回归模型有效。研究结果对兔骨和其他畜禽骨的精深加工具有一定的参考价值。

粒径；优化；模型；纳米级兔骨粉

0 引 言

兔肉作为一种绿色健康肉类，其营养价值可以概括为“四高”（高蛋白、高卵磷脂、高赖氨酸、高消化率）和“四低”（低脂肪、低胆固醇、低尿酸、低热量）[1-4]；同时，兔肉也被视为功能性肉制品而风靡全球，成为当代追求营养与健康肉制品消费者的首选[5]。根据联合国粮农组织（FAO）2016年的统计资料显示[6]，2013年世界兔肉的总产量为173.9万t，而中国继续以72.4万t的兔肉总产量稳居世界前列。

伴随兔肉产量的增加，兔骨等兔肉加工副产品也随之增多，和其他畜禽骨一样，兔骨具有丰富的营养价值，而畜禽骨骼在国内外主要被用作饲料生产[7-9]，只有一小部分被用来精深加工，如制成骨粉[10]、骨泥[11]等全骨产品和一些骨蛋白[12-13]、骨素[14-15]、骨钙[16-17]、骨胶[18-19]、骨油[20]、骨香精[21-22]等骨类提取物。总体来讲，由于畜禽骨的骨骼强度较硬、加工成本较大以及不易收集等原因，致使其深加工利用率低，造成了极大地资源浪费。

一般来讲，物质的粒径越小，其孔隙率和比表面积就越大，表面吸附力、溶解性和分散性等性质就越好[23-24]。另外，如果将颗粒的粒度降低到纳米尺度，其很可能会产生某些不同于常规颗粒的特性，即呈现出粒度效应，例如小尺寸效应、表面效应和催化效应等[25-27]。纳米颗粒的制备方法有化学方法和物理方法两种，其中物理方法中的物理粉碎法由于其生产量大、操作简便等优点在生产中应用较为广泛。物理粉碎法又可以分为湿法和干法两大类，Yin等[28]运用湿法球磨法得到了纳米鱼骨颗粒，并应用到鱼糜凝胶中；而干法球磨法在畜骨中的应用主要集中在超微骨粉的制备，如范露等[29]利用干法球磨法制得了平均粒径为9.33μm的鱼骨粉，姚晓云[30]运用行星式球磨机制得了平均粒径为22μm的鹿茸微粉，但关于干法球磨法制得纳米骨粉的报道还较少，鉴于此，本研究利用响应面法优化纳米级兔骨粉的干法球磨制备工艺，以期为兔骨精深加工的后续研究打下基础，也为畜禽骨的二次利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

伊拉兔骨，购自重庆市高校草食动物工程研究中心种兔场；菠萝蛋白酶30万U/g，南宁东恒华道生物科技有限责任公司；六偏磷酸钠试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

C21-2101电磁炉，广东美的精品电器制造有限公司；FD50A自动高压蒸汽灭菌器，（厦门）有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；MJ-25BM03A搅拌机，广东美的精品电器制造有限公司；SCIENTZ-12N冷冻干燥机，宁波心芝生物科技股份有限公司；XQM-0.4立式行星球磨机，长沙天创粉末技术有限公司；SB5200DTD超声波清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；JM-L50胶体磨，郑州玉祥食品机械有限公司；激光粒径分布仪Mastersizer 2000，Zetasizer Nano –ZS90纳米粒度及 Zeta电位分析仪，马尔文仪器（中国）上海思百吉仪器系统有限公司。200、300目标准检验筛，浙江上虞市华丰五金仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纳米兔骨粉的制备工艺流程和操作要点

工艺流程：兔骨切块→热烫去腥→高压蒸煮→剔除筋肉→酶解→灭活→绞肉机粗破碎→胶体磨研磨→真空冷冻干燥（真空度：(20±5) Pa，温度：(-35±4)℃，时间：24 h）→过200目标准筛→球磨机球磨→成品

操作要点：兔骨切块，以70日龄伊拉兔的脊骨、肋骨和腿骨为试验原料（其中脊骨和肋骨的总质量与腿骨的质量比为 4∶1：在试验的过程中发现，经过高压蒸煮加工工艺处理后，肋骨和脊骨一触就碎，并且无明显的颗粒感，而腿骨较前两者具有一定的颗粒感，并且后续的工艺证明，腿骨的添加量会影响最终纳米颗粒平均粒径的稳定性，数据波动较大，当把它们的质量比控制在4∶1时，数据较为稳定，因此选取肋骨和脊骨总质量与腿骨的质量比为4∶1。），把兔骨均匀切成2 cm×2 cm左右的块状。

热烫去腥：将切好的兔骨放入100 ℃水中热烫2 min，以除去血腥味。

高温高压蒸煮：根据单因素试验，确定合适的蒸煮温度、蒸煮时间、料液比。

酶解：由于畜禽骨主要是由胶原蛋白和羟基磷灰石组成的网状结构[31]，用菠萝蛋白酶对兔骨进行酶解，以部分降解骨骼中的胶原蛋白，从而破坏兔骨的整体结构，降低其加工强度，为后续试验打下基础；酶解工艺条件参考张小丽[32]的方法并做少许改变，酶解条件为：酶用量5 000 U/g，底物质量分数为15%，酶解温度60 ℃，酶解时间4 h。

胶体磨研磨：研磨工艺按照蔡蕊[9]的方法并做少许变动，将胶体磨的动静磨片间距调至最小，调节兔骨泥与水的比例为1∶1.5，然后过胶体磨15 min。

球磨机球磨：每个球罐中磨球的总质量为（60.00±1.02）g，其中大球（直径为1.2 cm）占总质量的20%；中球（直径为0.8～1.0 cm）占总质量的50%；小球（直径为0.5 cm）占总质量的30%。根据单因素试验，确定相应的球磨时间、转速和球料比（磨球与物料的质量比），然后进行响应面分析，确定最佳的球磨工艺。

1.3.2 兔骨高温高压蒸煮条件的确定

在蒸煮温度120 ℃，蒸煮时间2h的条件下讨论料液比（质量比）：1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3 对兔骨粉200、300目标准筛过筛率的影响；在蒸煮温度120 ℃，料液比1∶1.5条件下讨论蒸煮时间：0.5、1、1.5、2、2.5 h对兔骨粉200、300目标准筛过筛率的影响；在蒸煮时间2 h，料液比1∶1.5的条件下讨论蒸煮温度：105、110、115、120、125 ℃对兔骨粉200、300目标准筛过筛率的影响。根据单因素试验，确定合适的兔骨高温高压蒸煮条件。

1.3.3 兔骨粉球磨前理化性质的测定

将真空冷冻干燥后的兔骨粉过 200目标准筛，对通过标准筛的兔骨粉（即球磨前兔骨粉）的含水率、粒度进行测定，从而了解兔骨粉球磨前的相关性质。

1.3.4 纳米兔骨粉的球磨制备条件优化

单因素试验：在球磨转速500 r/min，时间4 h条件下讨论球料比(质量比)：1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1对兔骨粉平均粒径和分布系数（PDI, polydispersity index）的影响；在球磨转速500 r/min，球料比4:1的条件下讨论时间：2、3、4、5、6 h对兔骨粉平均粒径和PDI的影响；在球磨时间4 h，球料比4∶1的条件下讨论转速300、400、500、600、700 r/min对兔骨粉平均粒径和PDI的影响。

响应面试验设计：在单因素试验结果的基础之上，以平均粒径和 PDI为指标，采用三因素三水平的Box-Behnken响应面设计方法，对球磨转速、球磨时间、球料比这3个因素进行优化试验。

表1 响应面因素与水平Table 1 Factors and levels of RSM

1.3.5 指标测定方法

过筛率的测定：取5 g处理后的样品，过标准筛，重复测定3次，取平均值，过筛率的计算按照公式（1）：

式中R为过筛率，%；M1为穿透过标准筛样品的质量，g；M2为样品的总质量，g，本文取5 g。

水分的测定：参照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》。

粒度的测定：球磨前兔骨粉的粒度采用激光粒度分布仪测定，兔骨粉的平均粒径采用中位粒径（D50）表示。

平均粒径和PDI的测定：具体参照尹涛[33]的方法并稍做变动，加去离子水调整纳米兔骨悬浮液的质量分数为0.1%后，采用动态光散射的方法，用Nano ZS90激光粒度分布仪测定纳米级兔骨粉的平均粒径和PDI（particle dispersion index）。测试粒度前，加入质量分数为0.2%的六偏磷酸钠，然后用超声波振荡器在100 W功率下处理15 min以分散聚集的颗粒。

1.3.6 数据处理方法

运用 SPSS22.0、Excel-2010软件对单因素试验的数据进行方差分析；运用Mastersizer 2000软件对球磨前兔骨粉的粒度进行分析；利用Design-Expert 8.0软件对响应面的数据进行方差和线性回归分析。

2 结果与分析

2.1 兔骨高温高压蒸煮工艺条件的单因素试验结果

2.1.1 料液比对兔骨粉过筛率的影响

由图1a可得，兔骨粉200、300目标准筛的过筛率随着料液比的增加逐渐增大，料液比对过筛率的影响显著（P<0.05），这与蔡蕊[9]等认为料液比对鸡骨的硬度没有显著影响的试验结果存在差异，可能是由于不同的评价指标所引起的。如图所示，在料液比为1∶3时，过筛率达到最大值，200目的过筛率达到89.87%，300目过筛率达到69.38%，但由于料液比越大，其所需要的升温时间就越长，能耗也越多。综合考虑，选取1∶1.5作为兔骨高温高压蒸煮的较适料液比。

图1 不同蒸煮条件对过筛率的影响Fig.1 Effect of different cooking conditions on sieving rate

2.1.2 蒸煮时间对兔骨粉过筛率的影响

由图1b可得，兔骨粉200、300目标准筛的过筛率随着蒸煮时间的增加逐渐增大，蒸煮时间对过筛率的影响显著（P<0.05）。在蒸煮时间为2.5 h时，过筛率达到最大值，200目的过筛率达到 86.15%，300目过筛率达到67.13%，但考虑到时间成本，选取2 h作为兔骨高温高压蒸煮的较适时间。

2.1.3 蒸煮温度对兔骨粉过筛率的影响

由图1c可得，兔骨粉200、300目标准筛的过筛率随着蒸煮温度的升高逐渐增大，蒸煮温度对过筛率的影响显著（P<0.05）。在蒸煮温度为125 ℃时，过筛率达到最大值，200目的过筛率达到 88.70%，300目过筛率达到67.16%，考虑到加工成本，选取120 ℃作为兔骨高温高压蒸煮的较适温度。

2.2 兔骨粉球磨前的理化性质

由图 2可知，球磨前兔骨粉的含水率为 3.07%±0.05%，平均粒径为（65.92±1.71）μm，粒度分布如下图所示，可以看出球磨前兔骨粉的粒径分布比较广泛。

图2 兔骨粉球磨前的粒度分布Fig.2 Size distribution of rabbit bone before milling

2.3 纳米级兔骨粉球磨制备工艺的单因素试验结果

2.3.1 球料比对兔骨粉平均粒径和PDI的影响

由图3a可知，在球料比为1∶1～4∶1时，兔骨粉的平均粒径随着球料比的增加而显著减小（P<0.05），这是因为过多的兔骨粉料产生了过大的阻力，阻碍了球磨的机械运动，从而造成了不必要的能量损失。当球料比大于4∶1时，随着球料比的增加，兔骨粉的平均粒径呈现上升趋势，但基本趋于稳定。在球料比为1∶1～3∶1时，PDI随着球料比的增加而显著减小（P<0.05），表明在此范围，随着球料比的增加，骨粉的粒径分布更趋于均匀和集中；当球料比大于3∶1时，PDI变化不显著（P>0.05）。由于平均粒径和PDI的这种变化在球料比大于4∶1时趋于稳定，因此，综合以上两个指标和加工成本，选取纳米级兔骨粉球磨的最佳球料比为4∶1，选择3∶1、4∶1、5∶1 3个水平进行响应面试验。

2.3.2 球磨时间对兔骨粉平均粒径和PDI的影响

由图3b可知，兔骨粉的平均粒径和PDI都随着球磨时间的增加而显著减小（P<0.05），这与范露等[29]的研究结果相似，这是因为随着球磨时间的增加，球磨对骨粉的累积破坏程度逐渐增大，当时间大于4 h后，这种减小趋势逐渐趋于平缓。综合以上两个指标和时间成本，选取纳米级兔骨粉球磨的最佳时间为4 h，选择3、4、5 h 3个水平进行响应面试验。

2.3.3 球磨转速对兔骨粉平均粒径和PDI的影响

由图3c可知，兔骨粉的平均粒径和PDI都随着球磨转速的增加而显著减小（P<0.05），这与尹涛[33]的研究结果相似，这是因为随着球磨转速的增加，球罐中的磨球在单位时间内与兔骨粉的接触频率越大，对其的物理作用力也越大，因此对其的破坏程度也就越大。当转速大于500 r/min后，这种减小趋势逐渐趋于平缓。综合以上两个指标和加工产生的能耗，选取纳米级兔骨粉球磨的最佳转速为500 r/min，选择400、500、600 r/min 3个水平进行响应面试验。

图3 不同球磨条件对平均粒径和PDI的影响Fig.3 Effect of different milling conditions on average particle size and polydispersity index (PDI)

2.4 纳米级兔骨粉球磨制备工艺的响应面优化试验

以平均粒径为响应值的响应面分析结果：将表 2中平均粒径的数据运用 Design-Expert 8.0软件进行统计分析，得到的二次回归方程

式中Y1为兔骨粉的平均粒径（nm），A为球磨时间（h），B为球磨转速（r/min），C为球料比。

从表3可以看出，模型的P<0.000 1，极显著；失拟项P>0.05，不显著，说明其他因素对试验结果的干扰很小。回归决定模型系数R2=0.985 3，表明平均粒径的实际值与预测值之间有较好的拟合相关性，能够很好的反映出纳米级兔骨粉的平均粒径与球磨时间、转速和球料比的关系，信噪比为 24.009>4，表明该回归方程的可信度很高，变异系数为 2.25%<15%，表明试验重现性好，可靠性较高。综上表明，以平均粒径为响应值所建立的纳米级兔骨粉球磨制备优化工艺的模型是合理的，该模型适合对纳米级兔骨粉的球磨制备工艺参数进行优化和对平均粒径结果进行预测。

表2 响应面分析方案与试验结果Table 2 Program and experimental data of RSM

表3 平均粒径回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model on average particle size

从表 3中回归方程各项系数的显著性检验可得，该模型的一次项A和B极显著（P<0.01），C显著（P<0.05）；交互作用项AB极显著（P<0.01）；平方项A2、B2、C2均极显著（P<0.01）。说明球磨时间、转速、球料比对纳米级兔骨粉的平均粒径都有一定的影响，就影响程度而言，转速>时间>球料比。此外，球磨时间和转速有极显著的交互作用，而球磨时间和球料比、球磨转速和球料比交互性不显著。

响应面二维等高线图和 3D图可以较为直观的分析出响应值随着不同因素的改变而发生的变化情况。3D图中的曲面越陡峭，表明该因素对响应值的影响也就越大。等高线图越近似椭圆形，表明这两个因素对响应值的交互作用就越强，若近似圆形，表明这两个因素间的交互作用就越弱。由上述的方差分析结果可知，时间和球料比、转速和球料比交互作用不显著，故只选时间和转速的交互作用进行分析。

由图4a可知，响应面的坡度较陡，表明纳米级兔骨粉的平均粒径受球磨时间和转速的影响较大；而且平均粒径随着球磨时间和转速的增加呈现减小的趋势。从等高线密度可以看出，转速轴向等高线密度相对较大，表示转速对平均粒径的影响比时间的影响大，与表3分析一致。

图4 不同因素之间交互影响响应值的响应面Fig.4 Response surface of interactive effects on response value of different factors

以PDI为响应值的响应面分析结果：将表2中PDI的数据运用Design-Expert 8.0软件进行统计分析，得到二次回归方程

式中Y2为兔骨粉的PDI。

从表4可以看出，模型的P<0.000 1，极显著；失拟项P>0.05，不显著，说明其他因素对试验结果的干扰很小。回归模型决定系数R2=0.974 7，表明PDI的实际值与预测值之间有较好的拟合相关性，能够很好的反映出纳米级兔骨粉的 PDI与球磨时间、转速和球料比的关系，信噪比为 19.758>4，表明该回归方程的可信度很高，变异系数为1.32%<15%，表明试验重现性好，可靠性较高。综上表明，以PDI为响应值所建立的纳米级兔骨粉球磨制备优化工艺的模型是合理的，该模型适合对纳米级兔骨粉的球磨制备工艺参数进行优化和对PDI结果进行预测。

从表 4中回归方程各项系数的显著性检验可得，该模型的一次项A和B极显著（P<0.01），C不显著（P>0.05）；交互作用项AB显著（P<0.05）；平方项B2极显著（P<0.01）。说明球磨时间、转速、球料比对纳米级兔骨粉的PDI都有一定的影响，就影响程度而言，转速>时间>球料比。此外球磨时间和转速有显著的交互作用，而球磨时间和球料比、球磨转速和球料比交互作用不显著。

表4 PDI回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model on PDI

由上述的方差分析结果可知，时间和球料比、转速和球料比交互作用不显著，故只选时间和转速的交互作用进行分析。

由图4b可知，响应面的坡度相对较陡，表明纳米级兔骨粉的 PDI受球磨时间和转速的影响相对较大；而且PDI随着球磨时间和转速的增加呈现减小的趋势。从等高线密度可以看出，转速轴向等高线密度相对较大，表示转速对PDI的影响比时间的影响大，与表4分析一致。

2.5 优化试验

由于本试验的主要目的就是减小纳米级兔骨粉的平均粒径，PDI值只是一个参考因素，所以对上述两个指标进行综合考虑，并分别赋予它们一定的重要度，其中平均粒径重要度为3，PDI为1。经过Design-Expert 8.0软件统计分析，得出纳米级兔骨粉的最优球磨工艺为球磨时间4.71 h，转速558.12 r/min，球料比3.66∶1，平均粒径的预测值为484.7 nm，PDI的预测值为0.487。考虑到实际生产中的可操作性，将以上工艺调整为：时间4.7 h，转速558 r/min，球料比3.66∶1。在此条件下进行3次平行试验，得到实际纳米级兔骨粉的平均粒径为（502.5±11.7）nm，PDI为0.497±0.021，与理论预测值的相对误差均小于 5%。因此，经响应面法优化得到的纳米级兔骨粉最佳制备工艺参数准确可靠，具有一定的实际应用价值。

3 结 论

1）经过单因素试验，得到兔骨的最佳高温高压蒸煮条件为蒸煮时间2 h，蒸煮温度120 ℃，料液比1∶1.5。2）通过单因素和Box-Behnken响应面试验，建立了纳米级兔骨粉球磨制备工艺的数学模型，得到最佳的球磨工艺条件为：时间4.7 h，转速558 r/min，球料比3.66∶1。在此条件下制得的纳米级兔骨粉的平均粒径从球磨前的（65.92±1.71）μm 降低到（502.5±11.7）nm，PDI 为0.497±0.021，与理论预测值的相对误差均小于5%，说明该模型对准确预测纳米级兔骨粉的球磨制备工艺参数具有一定的应用价值，对兔骨和其它畜禽骨的精深加工具有一定的指导意义。

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Optimization of preparation process of nanometer rabbit bone meal by ball milling

Li Shaobo1, Li Hongjun1,2※, He Zhifei1,2
(1.College of Food Science, Southwest University,Chongqing400716,China; 2.Chongqing Engineering Research Center of Regional Food, Chongqing400716,China)

Rabbit meat as a kind of green and healthy meat, contains a lot of nutrients. With the increase of the yield of rabbit meat, rabbit bone and other rabbit meat processing by-products are increasing. Rabbit bone has high nutritional value like other livestock and poultry bone, but it is mostly used for primary processing, such as animal feed, and it has a low rate of deep processing utilization, which results in a great waste of resources. So it is very necessary for us to find a new form of utilization for it. Generally speaking, the smaller the particle size, the greater the porosity and specific surface area, and the better the surface adsorption capacity, solubility and dispersion. In addition, if the particle size is reduced to the nanometer scale, it is likely to produce some characteristics which are different from that of conventional particles, such as small size effect, surface effect and catalysis effect. Therefore, in this study, the response surface method was used to find the best preparation technology of the nanometer rabbit bone meal. The spines, ribs and legs of 70-day-age Ira rabbits were used as raw materials (the ratio of total mass of spines and ribs to mass of legs was 4:1), and multiple treatments were adopted to process these bones, such as high pressure cooking, protease hydrolysis, colloid mill grinding, vacuum freeze drying, standard sieve sieving, and ball milling; the method of dynamic light scattering was used to measure the average particle size and the particle dispersion index (PDI) of rabbit bone meal. On the basis of single factor tests, the response surface method was employed to optimize the preparing parameters of nanometer rabbit bone meal, and the quadratic regression equation was established to find the best processing conditions. The results illustrated that the optional preparation conditions were as follows: Ball-milling speed was 558 r/min, ball-milling time was 4.7 h, and ball-material ratio was 3.66:1. Three validation tests were carried out under these conditions, and the results showed that the actual verification value of the average particle size of nanometer rabbit bone meal was (502.5±11.7) nm, the actual verification value of the PDI of nanometer rabbit bone meal was 0.497±0.021, and the relative errors between the predicted values and measured values were less than 5%, which indicated that the regression model was reliable and had practical value in the deep processing of rabbit bone. The results provide a reference for the follow-up study of deep processing of rabbit bone and other livestock poultry bone.

particle size; optimization; models; nanometer rabbit bone meal

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.14.040

TS251

A

1002-6819(2017)-14-0300-07

李少博，李洪军，贺稚非. 纳米级兔骨粉球磨法制备工艺优化[J]. 农业工程学报，2017，33(14)：300－306.

doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.14.040 http://www.tcsae.org

Li Shaobo, Li Hongjun, He Zhifei. Optimization of preparation process of nanometer rabbit bone meal by ball milling[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(14): 300－306. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.14.040 http://www.tcsae.org

2016-11-16

2017-06-23

国家自然科学基金项目（31671787）；国家公益性行业（农业）科研专项（201303144）；国家兔产业技术体系肉加工与综合利用（CARS-44-D-1）；重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目（cstc2014pt- gc8001）作者简介：李少博，男，研究方向为肉类科学与酶工程。重庆 西南大学食品科学学院，400716。Email：251196 216 7@qq.com

※通信作者：李洪军，男，教授，博士，研究方向为肉类科学与酶工程。重庆 西南大学食品科学学院，400716。Email：983362225@qq.com