酶联免疫法快速检测奶粉中的叶酸

李江,严家俊,綦艳,佘之蕴,张娟,黄宝莹,赵玲

(广东产品质量监督检验研究院,国家食品质量监督检验中心(广东),佛山 528300)

酶联免疫法快速检测奶粉中的叶酸

李江,严家俊,綦艳,佘之蕴,张娟,黄宝莹,赵玲

(广东产品质量监督检验研究院,国家食品质量监督检验中心(广东),佛山 528300)

建立一种检测奶粉中叶酸质量分数的酶联免疫分析方法.奶粉样本经纯水溶解提取,再做1∶4稀释,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定奶粉中的叶酸.结果表明,当加标质量分数为20,40 μg/kg和80 μg/kg时,空白基质奶粉中叶酸的提取回收率为93.5%~118.0%;非空白基质样品中叶酸的加标回收率为88%~92%;方法检出限为4 μg/kg;与高效液相色谱法结果的相对偏差小于10%.酶联免疫法能够快速、准确检测奶粉中的叶酸.

叶酸;酶联免疫法;奶粉

0 引言

叶酸,也叫维生素B9,是一种重要的水溶性B族维生素[1],缺乏叶酸会导致人体产生各种疾病,如孕妇缺乏叶酸会造成新生儿神经管缺陷(NTDs)或无脑等疾病[2-3].目前,《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》规定婴幼儿配方乳粉中叶酸限值:一为500~2 500 μg/kg[4].叶酸是人体维持正常生理功能必须的微量物质,对孕妇和新生儿也有着特殊的重要性[5],因此建立一种快速、准确的检测分析方法就显得格外重要.

现叶酸含量多采用紫外分光光度法、荧光法[6-7]、液相色谱法和高效液相色谱质谱联用等方法[8-9],由于婴幼儿乳制品中叶酸含量低、基质复杂,定量分析困难;而ELISA法因其检测结果快速准确,灵敏度高,操作简便,可广泛用于奶粉样品中叶酸的检测.

1 实验

1.1 试剂与仪器

甲醇(分析纯),叶酸标准品.

叶酸检测试剂盒,试剂盒的组成:包被有叶酸抗原的酶标板、叶酸抗体、酶标二抗、叶酸标准品、底物显色A、B液、终止液和浓缩洗涤液,试剂盒快速、准确、稳定,无需长时间培养.

MULTISKAN MK3酶标仪,涡旋仪,Thermo高速离心机,微量移液器,Gamp;G电子天平.

奶粉样本(市售).

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

称取2.0 g奶粉样品于50 mL离心管中,加入40 mL纯水溶解;于涡旋仪上剧烈振荡2 min至奶粉充分溶解;取200 μL上述样品,加入800 μL样本稀释液;充分振荡混匀,取50 μL进行分析.

1.2.2 ELISA检测样本中叶酸

将叶酸检测试剂盒从冰箱中取出,置于室温(23~25℃)平衡30~40 min,取出微孔板,将样本和标准品对应微孔按序编号;加入标准品或样本50 μL到对应的微孔中,加入叶酸酶标物50 μL/孔,再加入叶酸抗试剂50 μL/孔,轻微摇动混匀,置室温避光反应30 min;反应时间结束,小心揭开膜,将微孔内液体甩干,用洗涤液300 μL/孔,充分洗涤5次,每次间隔15 s,然后在吸水纸上拍干;加入底物显色A液50 μL/孔,再加入底物显色B液50 μL/孔,轻轻摇动混匀,置室温避光反应15 min;反应时间结束,加入终止液50 μL/孔,在双波长450/630 nm处测定每孔OD值.

1.3 定量分析方法

采用试剂盒专用的分析软件对结果进行分析,该试剂盒灵敏度为0.003 μg/kg,变异系数小于10%.最终检测结果以实际测定的吸光度值与稀释倍数换算后得出.

2 结果与分析

2.1 加标回收率结果

对加标后的空白基质奶粉(加标浓度分别为20.0,40.0 μg/kg和80.0 μg/kg)按照试剂盒操作方法提取、稀释、测定(双孔双平行),计算出叶酸加标回收率的结果(见表1).由表1可知,加标回收率结果在93.5%~118.0%,说明该方法适用于奶粉中叶酸的测定.

表1 空白基质样品加标回收率结果(n=6)

2.2 进一步增大稀释比例结果

为使检测结果更加准确,在提取比例1∶20不变条件下对提取后的稀释比例进一步分析、优化,考虑方法检出限不能过高的原因,因此选取1∶4,、1∶6和1∶9(体积比)三个稀释比例,的检测结果,由结果可知三个稀释比例条件下回收率都在可接受的范围内(见表2),本研究方法选用1∶4比例稀释,样本检测结果见表3.

2.3 方法检出限

用试剂盒分别检测6份采用液相色谱方法测定为阴性的样本,计算样本中叶酸的质量分数,方法的检出限等于阴性空白样本的检测平均值加上阴性样本检测浓度的3倍标准偏差,检测结果如表4所示.

表2 进一步增加稀释比例的回收率结果(n=6)

表3 样本检测结果

表4 方法检出限的结果(n=6)

2.4 结果与液相方法比较

为确定研究方法的准确性,选取已知浓度的5个奶粉样本与液相检测结果进行比较(表5).由表5结果可以看出,试剂盒法与液相法符合率在91.4%~107.5%,相对标准偏差小于10%,说明该方法能够对奶粉中叶酸进行定量检测.

表5 试剂盒方法与液相方法检测结果对比

3 结论

建立了一种对奶粉中叶酸进行检测的酶联免疫分析方法,通过对整个检测体系的优化,用纯水1∶20提取,再以1∶4水稀释,方法灵敏度高,精密度均小于10%,与液相检测结果标准偏差小于10%,检测效率高、实验周期短、为进一步探究其他食品中叶酸的检测奠定了基础.

[1]文小青,杨月欣.食物中维生素A、叶酸和维生素E分析方法研究进展[J].中国食品卫生杂志,2004,16(1):65-70.

[2]刘莉治,罗晓燕,周洪伟,等.高效液相柱后衍生法测定婴幼儿食品中的叶酸[J].中国卫生检验杂志,2007,17(7):1179-1180.

[3]黄宏南,陈宏靖,黄健文,等.高效液相色谱荧光快速测定保健食品中的叶酸[J].中国卫生检验杂志,2002,12(1):70-70.

[4]GB 14880-2012食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准[S]2012.

[5]罗敏婷,吴克刚,黄伟乾,等.婴幼儿辅食营养补充品中叶酸的测定方法[J].食品与机械,2016,32(9):34-38.

[6]郭健,李敏,孟妍,等.荧光分光光度法测定食品中叶酸的含量[J].中国公共卫生,2003,19(10):1259-1259.

[7]李全霞,崔亚娟,赵寅菲,等.微生物法测定食品中水溶性维生素的原理及进展[J].食品科学,2013,34(13):338-344.

[8]陈雄,吴周和,吴传茂,等.利用高效液相色谱仪初步研究叶酸的稳定性[J].食品科学,2001,22(7):70-71.

[9]王凤玲,刘爱国,孙佳佳,等.高效液相色谱-质谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中叶酸、VB12和生物素[J].食品科学,2013,34(22):269-272.

Rapid detection of folic acid in milk powder by enzyme linked immunosor bent assay

LI Jiang,YAN Jiajun,QI Yan,SHE Zhiyun,ZHANG Juan,HUANG Baoying,ZHAO Ling
(Guangdong Testing Institute for Product Quality Supervision,China National Quality Supervision and Testing Center for Foods,Foshan 528300,China)

To establish a method for the detection of folic acid in milk powder by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Milk pow⁃der was extracted with pure water and processed with 1∶4 dilution,and then the content of folic acid in samples was determined by ELISA.When the spiked concentrations were 20,40 μg/kg and 80 μg/kg,the recoveries of folic acid in blank milk powder were 93.5%~118.0%;the recoveries of folic acid in milk powder were 88%~92%;the limit of detection was 4 μg/kg.Compared with the high performance liquid chromatography(HPLC)method,the relative standard deviation of result was less than 10%.This method can detect folic acid in milk pow⁃der quickly and accurately.

folic acid;enzyme linked immunosorbent assay;milk powder

TS252.7

A

1001-2230(2017)10-0037-02

2017-04-07

国家质检总局项目(2013QK281).

李江(1985-),男,工程师,主要研究方向为食品安全风险评估和毒理学研究.