头穴丛刺联合汤药对脑缺血大鼠影响的对比研究*

潘军英,王浩飏，颜 妮，王 军，丁玉鑫，宋仲涛,周海纯

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

头穴丛刺联合汤药对脑缺血大鼠影响的对比研究*

潘军英1,王浩飏1，颜 妮1，王 军1，丁玉鑫1，宋仲涛1,周海纯2△

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的：对比研究头穴丛刺联合经验方治疗脑缺血大鼠的作用及机制。方法：选取健康大鼠随机分组，预标记48 h后行MCAO造模，治疗方法采用头穴丛刺联合补阳还五汤原方及头穴丛刺联合加味经验方分组治疗。在各时间点分别处死取材，以神经功能评定、行为学评定、病理学检查和Western blot分别测定Hes5蛋白指标，对比研究，观察头穴丛刺联合加味经验方对模型大鼠NSC的影响。结果：经过大量处方筛选发现，头穴丛刺联合补阳还五汤传统组方在加入醉魂藤、走马芹、钻秆虫等药材后，在神经功能评分、行为学功能评分方面两种治疗方法治疗脑缺血大鼠均有作用，但加味经验方作用更佳(P<0.05)。检测脑组织含水量在梗死周边区的表达Hes5蛋白，指标发现两种治疗方法治疗脑缺血大鼠均有作用，但加味经验方组作用更佳(P<0.01)。结论：头穴丛刺联合补阳还五汤传统组方加入醉魂藤、走马芹、钻秆虫等药材后作用最佳，其作用机制可能是参与影响脑梗死后神经干细胞的增殖、迁移和分化。

头穴丛刺；针刺疗法；神经干细胞；补阳还五汤

脑缺血是由脑血管血液循环不畅或供血不足导致的大脑局部缺血性疾病，占脑卒中患者比例的85%左右。脑缺血属于临床高发性脑血管疾病，在全球各国均具有极高的发病率，且具有复发率高、死亡率高的特点[1]。由于该病极易导致神经损伤，引发面瘫、半身不遂、癫痫甚至导致劳动力丧失，因此已成为严重影响我国中老年患者生存质量的常见疾病和多发疾病[2]。

补阳还五汤由黄芪、当归尾、赤芍、桃仁、红花、川芎、地龙配制而成，初见于王清任的《医林改错》，影响深广[3]，是中医著名的传统理血剂，具有补气、活血、通络之功效，主治气虚血瘀证、半身不遂、口眼斜、语言謇涩、口角流涎[4]。经临证加减，临床治疗脑缺血的有效率达40%～80%。

但现代药理学研究显示，补阳还五汤用于治疗脑缺血时，其组方仍存在不合理之处。但关于补阳还五汤如何进行组方优化，以提高对脑缺血的疗效，仍存在争议。部分研究者认为加大方中黄芪有利于提高对脑缺血的疗效；而部分研究者经过严谨的拆方分析则发现，方中黄芪作为补气成分对脑缺血无治疗作用，因此认为应当加大活血祛瘀组分(当归尾、赤芍、桃仁、红花、川芎)的用量[5]。头穴丛刺目前临床已经进行了大量研究，证明能使脑皮层神经细胞的兴奋性得到改善，使抑制性泛化得以纠正，能够促进可逆性神经细胞复活，使被抑制的神经细胞觉醒，改善缺血性半暗带的局部神经元的低氧超极化状态，促进神经干细胞增殖、迁移、分化能力，使得神经功能尽快恢复。临床医生经常针药并用，作用优于单法。

鉴于此，目前仍需要进行进一步的优化研究，以提高其对脑缺血的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 造模

健康雄性SPF级SD大鼠，体质量为(180±20)g，实验动物来源由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号：00101006。饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心SPF实验室。采用线拴法制备大鼠大脑中动脉缺血性脑梗死模型。

预标记48 h后参照Zea Longa等建立的大鼠大脑中动脉内栓线阻断方法，行大脑中动脉阻塞术(MCAO)。

1.2 模型分组

选择实验动物，一般情况良好时，开始进行实验，分为假手术组(Sham-OP)、模型组(MCAO)、头穴丛刺联合补阳还五汤原方组(MCAO+LFA)和头穴丛刺联合补阳还五汤加味组(MCAO+HFA)，每组15只。术前12 h禁食，自由饮水。

1.3 抗体

Hes5 (A-17) 抗体 (Santa Cruz Biotechnology，# sc-13859);Hes5兔源多克隆抗体(cam公司，#194111);β-Actin (13E5) Rbit m (CST公司，货号#4970)。

1.4 治疗方法

1.4.1 方剂制备 补阳还五汤及加味补阳还五汤药材均购自黑龙江中医药大学附属第二医院草药局。补阳还五汤方按原方组成:黄芪:当归尾:赤芍:地龙:川芎:桃仁:红花=40∶2∶1.5∶1∶1∶1∶1。方剂制备予清水浸泡30 min。第一煎加药材及5倍体积双蒸水，煎汁60 min。二煎5倍体积双蒸水，煎汁60 min。两煎混匀，浓缩为总方2.68 g/ml，冷藏备用。

补阳还五汤加味方依据补阳还五汤原方用量比例，按原方组成:黄芪∶当归尾∶赤芍∶地龙∶川芎∶桃仁∶红花=40∶2∶1.5∶1∶1∶1∶1，再按比例加上醉魂藤、走马芹、钻秆虫各1.5，方剂制备方法同前。

1.4.2 头穴丛刺 取穴:依据“大鼠穴位图谱”，选取百会穴及百会穴左、右侧各旁开2 mm处3个穴位。刺法:采用头穴丛刺长留针法针刺，针刺方向为向眼的方向，刺入深度为沿皮平刺大约3 mm。手法:快速捻转行针5 min，后留针6 h，每日1次，共治疗2周。

1.5 治疗方案

1.5.1 模型组 术后另置单独普通笼中常规饲养，不予任何治疗，给予等体积双蒸馏水。

1.5.2 原方组 给药量按照人体和动物的体表面积进行折算，大鼠以体重250 g计算，折算后给药量约为每天5 g/kg。每日灌胃给药2次。

1.5.3 加味组 予加味补阳还五汤灌胃给药治疗。给药方法同原方组。

1.5.4 假手术组 只进行分离动脉，不予结扎插线手术，术后常规单组饲养，给予等体积双蒸馏水并标记。

1.6 神经功能评定

模型大鼠建立成功24 h后，参照Bederson 4级评分标准在治疗前、治疗后7天、14天分别对各组大鼠进行评分[7]。

1.7 行为学功能测验

对各组大鼠在治疗前、治疗后7天、14天进行行为学功能测验[6-7]，观察大鼠行为学方面存在的差异。行为学功能测验过程中，每只大鼠反复操作两次，对两次得分进行比较，取高分记为测验分值。实验环境要求室温、安静、整洁。

1.8 Western Blot检测

操作：蛋白质膜上转移。检测：已知表达蛋白，抗体检测。检测：Western免疫印迹(Western Blot)是首先通过实验操作实现样品蛋白的膜转移，成功之后选择相应抗体对样品蛋白进行检测。

抗体选择：已知表达蛋白选择相应对应抗体实现一抗检测；新基因的表达产物选择融合部分的抗体检测。

采用融合部分的抗体针对新基因的表达产物进行系统检测。基本步骤：步骤一：检验样品制备保存;步骤二：样品电泳分离实验;步骤三：样品蛋白的膜转移;步骤四：免疫杂交显色检测。

1.9 统计学分析

2 结果

假手术组神经功能评定、行为学功能测验数值接近正常，与模型组有较大差异，仅用于验证造模成功，故未录入数据统计。

2.1 神经功能评定

实验结果显示:针药法在治疗7天、14天后对于缺血性中风大鼠动物模型的神经功能恢复效果显著(P<0.05或P<0.01)，且加味补阳还五汤疗效明显优于补阳还五汤原方疗效(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠在不同时间点神经功能评分的比较

注：与模型组比较,①P>0.05,②P<0.05,③P<0.01；与原方组比较，④P<0.05

2.2 行为学功能测验

实验结果显示:针药法在治疗7天、14天后对于缺血性中风大鼠动物模型的行为学功能恢复效果显著(P<0.01)，且加味补阳还五汤疗效明显优于补阳还五汤原方疗效(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠在不同时间点行为学功能评分的比较

注：与模型组比较,①P>0.05,②P<0.05,③P<0.01;与原方组比较，④P<0.05

2.3 病理形态学表达

假手术组脑神经细胞形态结构正常，脑组织未见充血坏死，未见血管出血表现;模型组血细胞浸润出血明显，脑神经细胞数量减少，可见细胞死亡;原方组脑血管见明显充血及出血，脑神经细胞数量减少，可见细胞死亡;加味组可见脑组织坏死灶，残存少量胶质细胞，能够发现格子细胞较多，边缘坏死有过渡，呈现周围神经细胞固缩性坏死。见封三彩图1。

2.4 Hes5蛋白表达及引物特异性检测

引物特异性检测采用融解曲线法，实验结果显示:神经元及神经胶质细胞中，Hes5蛋白都存在表达；蛋白表达及融解曲线可以看出在脑梗死后7天，各组Hes5蛋白表达全部显示到达高峰，各治疗组于各时间点，Hes5蛋白表达均显示较高水平，说明各种治疗方法均有效，与模型组比较，具有显著性差异；其中各个时间点加味组表达均高于原方组,具有显著性差异(P<0.05)。见图2、封三彩图3和表3。

图2 Hes5蛋白表达

表3 各组Hes 5蛋白表达

注：与模型组比较，BP<0.01;与原方组比较，bP<0.05

3 讨论

目前已经有大量研究报道证实了头穴丛刺及补阳还五汤对NSC的增殖、迁移、分化具有促进作用。但笔者在长期临床实践中观察脑缺血患者单用原方作用并不十分理想，所以在临床实践工作中，常常针药并用，同时在补阳还五汤的原方基础上加减变化[6-7]，在长期的实践观察中，笔者发现在临证时加大活血力度，获得疗效较为理想，本次研究的价值及创新点是本研究的研究人经过大量处方筛选发现，补阳还五汤传统组方在加入醉魂藤、走马芹、钻秆虫等药材后，对脑缺血大鼠的脑梗死面积及神经功能评分的改善作用，治疗效果与其它方法比较更为理想，但是，查阅大量文献没有找到相关报道进行理论支持，所以笔者从事此次研究实验，目的从分子水平，通过对比观察，为我们的临床实践提供可靠地论证。

在实验过程中遇到了诸多问题，方剂变方研究涉及的是一个典型的多因素多水平问题，对药物组合治疗方案进行优选，筛选对比研究，其作用已经十分清晰，所以本研究设立补阳还五汤原方为对照组重复验证其作用，本实验在补阳还五汤的基础上加入醉魂藤、走马芹、钻秆虫等药材，既具有临床观察证据，又存在现代药理研究证据，两者均能抗脑缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡，可以有效抑制脑缺血再灌注后脑中谷氨酸、天门冬氨酸及 GA含量的异常升高，减轻脑缺血神经元的损害，起到脑保护的作用，其作用机制也具有一定基础。然而中药方剂受各种因素影响，比如方剂中各种药物的配伍剂量，君臣佐使的配伍方法均存在着非常复杂的交互作用，方剂给药途径有口服灌肠等，各种给药方法也会对药物的吸收存在影响，中医时令服药的给药时间，理论上也会影响药物的治疗效果[8-9]，综上这些作用影响存在协同效应或拮抗效应。此次试验为了验证加味补阳还五汤的临床观察结果，在宏观评分及微观分子RNA水平进行了量化比较，本次研究仍然没有足够基础进行定量配伍剂量及君臣佐使的配伍方法分析，没有足够基础对药物间交互作用的性质(协同效应或拮抗效应)进行分析，未对中药组合之间的作用机制进行深入探讨[10]。只是依据临床经验在临床常用剂量基础上调整，所以本研究只是为了提高脑缺血的临床疗效，采用头穴丛刺联合加味补阳还五汤经验方的一次初步研究，在今后的系列研究中，笔者将对本次未完成的内容进行更深一步的研究，期待得出更加系统的各种基本数据和信息，为其在临床的使用贡献一份力量。

[1] 叶思文.加味补阳还五汤治疗气虚血瘀型脑梗死临床观察[J].山西中医,2015,31(10):45-46

[2] 李勇飞.黄芪桂枝五物汤加减治疗气虚血瘀型中风疗效观察[J].中医临床研究,2015,7(13):27-28

[3] 管华全,王义祁,欧阳思清,等.补阳还五汤中黄芪剂量对大鼠神经细胞凋亡的影响[J].中国临床研究,2014,27(2):132-134

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[5] Kim GJ,Choi HG,Kim JH,et al.Anti-allergic inflammatory effects of cyanogenic and phenolic glycosides from the seed ofPrunus persica[J].Nat Prod Commun,2013,8(12):1739-1740

[6] 王飞.低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控及功能研究[D].北京:中国人民解放军军事医学科学院,2013:10-12

[7] Rokuya Nochi,Tomomasa Kato,Jun Kaneko.Involvement of metotropic glutamate receptor 5 signaling in activity-related proliferation of adult hippocampal neural stem cells[J].European Journal of Neuroscience,2012,36(3):2273-2283

[8] 杨直堂.活化小胶质细胞在急性脑梗死中的作用及其机制的研究[D].郑州:郑州大学,2013:77-81

[9] 滕腾.星形胶质细胞原代培养与神经干细胞诱导分化生物学研究[D].上海:复旦大学,2012:26-29

[10] Gyory Idiko.Transcription factor Ebf1 regulates differentiation stage-specific signaling. proliferation and survival of B cells[J].Genes & Development,2012,26(7):1587-1604

ComparativeStudyofScalpClusteringAcupunctureCombinedwithDifferentMedicationsinCIRats

PANJun-ying1,WANGHao-yang1,YANNi1,WANGJun1,DINGYu-xin1,SONGZhong-tao1,ZHOUHai-chun2△

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective：To explore the effect and the mechanism of scalp clustering acupuncture combined with empirical formula in the treatment of cerebral ischemia(CI) in rats.MethodsMCAO was used to establish the models. The CI rats were randomly divided into group A(scalp clustering acupuncture+Buyang Huanwu decoction) and group B(scalp clustering acupuncture + empirical formula). Empirical formula was modified on the basis of Buyang Huanwu decoction, in which Zuihunteng(AsclepiadaceaeHeterostemmaalatum), Zoumaqin(Angelicadahurica), and Zuanganchong(Grain insects) were used. Evaluation of neurological function, assessment of behavior, examination of pathology, and expression of Hes5 protein were compared between the two groups to explore the effect and relative mechanism.ResultsIn terms of the scores of neurological function evaluation and behavior assessment, they were both elevated in the two groups; however, group B had better results(P<0.05). In terms of the expression of Hes5 protein around infarction border, it proved both treatments had therapeutic effects; treatment applied in group B was better(P<0.05).ConclusionThe therapy of scalp clustering acupuncture combined with modified empirical formula is more effective in treating CI rats, which mechanism may be related to its intervention in proliferation, migration, and differentiation of neural stem cell after cerebral infraction.

Scalp culstering acupuncturep; Acupuncture therapy; Neural stem cell; Buyang Huanwu decoction

R246.6

A

1005-0779(2017)11-0062-04

黑龙江中医药大学优秀创新人才支持计划“优秀青年教师支持人选”项目,编号：2012RCQ05；黑龙江中医药大学科研基金面上项目，编号：201722。

潘军英(1981-),男，主治医师，从事针灸推拿临床工作。

△

周海纯(1980-)，男，副主任医师，硕士研究生导师，主要从事针灸临床工作。

2017-05-22