针刀干预对帕金森病大鼠行为学和纹状体神经递质的影响*

徐 菁，芦 娟，郭 妍，梁靖蓉，马薇薇，卢胜春，郭长青△

(1.北京中医药大学，北京 100029; 2.江西德兴市胜春医院，江西 德兴 334224)

实验研究

针刀干预对帕金森病大鼠行为学和纹状体神经递质的影响*

徐 菁1，芦 娟1，郭 妍1，梁靖蓉1，马薇薇1，卢胜春2，郭长青1△

(1.北京中医药大学，北京 100029; 2.江西德兴市胜春医院，江西 德兴 334224)

目的：观察针刀干预对帕金森病(PD)大鼠行为学和纹状体神经递质DA、NA、5-HT含量的影响。方法： SD雄性大鼠，随机抽取16只作空白组，剩余采用右侧纹状体双靶点注射法成功制备PD大鼠模型后，随机分为模型组、电针组、针刀组。电针组电针“百会”“太阳”，每周3次；针刀组松解C1、C2横突后结节，每周2次。4周观察期后，采用APO诱导的旋转实验观察大鼠行为学变化， HE染色法光镜下观察中脑黑质形态学变化，高效液相色谱-电化学法检测纹状体DA、NA、5-HT的含量。结果：空白组不转圈，模型组转圈无变化，电针组和针刀组干预后转圈数较模型组减少显著(P<0.01)；模型组纹状体递质DA、NA、5-HT含量显著低于空白组(P<0.01)， 针刀组DA、NA、5-HT含量较模型组升高显著(P<0.01或P<0.05)。结论：针刀干预可减轻PD大鼠的行为学症状和升高纹状体神经递质DA、NA、5-HT含量，缓解帕金森病症状。

针刀疗法；帕金森病；行为学；神经递质；高效液相色谱-电化学法

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种中老年人高发的神经系统退行病变，病程长、致残率高、缺乏有效的治愈手段，严重影响患者生活[1]。目前国内约221万帕金森病患者，患病率达1.7%[2]，临床治疗以口服左旋多巴为主，早期缓解症状，不能延缓病情，且长期服药过程中引起的副作用也是困扰患者的一大难题。

针刀疗法结合针刺效应和剥离松解的优势作用，临床中用于治疗帕金森病有确定疗效[3]，但缺少关于其治疗机制的基础研究。本实验以PD模型大鼠为研究对象，旨在探讨针刀干预对PD大鼠行为学的影响以及对纹状体神经递质DA、NA、5-HT含量的调节作用，以期为临床针刀疗法治疗帕金森病提供实验依据和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

6-羟基多巴胺(6-OHDA,美国Sigma公司生产);阿扑吗啡(APO，美国Sigma公司生产);水合氯醛(天津市科密欧化学试剂中心生产)；多聚甲醛(常德市华生医疗器械有限公司生产)；0.9%氯化钠溶液(哈药集团三精制药有限公司生产)；多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NA)、五羟色胺(5-HT)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、柠檬酸(CA)、乙二胺四乙酸四钠盐(EDTA,AR级)；辛烷基磺酸钠(OSA,HPLC级，美国Sigma公司生产)；乙腈(ACN,HPLC级，美国Fisher Scientific公司生产)；高氯酸(HClO4);硫代硫酸钠(Na2S2O5,国产AR级)。

1.2 主要仪器

脑立体定位仪(美国Stoelting公司生产)；一次性无菌针灸针(0.25 mm×25 mm,北京中研太和医疗器械有限公司生产)； KWD-808Ⅰ型电针治疗仪(常州市华音电子有限公司生产)；一次性汉章系列无菌针刀(0.4 mm×40 mm,北京健力园医疗器械有限公司生产)；16通道Coularray库仑阵列电化学高效液相色谱仪及色谱工作站、5600A电化学检测器(均为美国ESA公司生产)；离心机MIKRO 22R(德国Hettich公司生产)；低温冰箱(法国JOUAN公司生产)；针筒式微孔滤膜过滤器(水系0.22 μm，天津腾达过滤器厂生产)。

1.3 实验动物及造模分组

SD健康雄性大鼠72只，SPF级，体质量(200±20)g，购于北京维通利华公司实验动物中心[生产许可批号:SCXK(京)2012-0001]。于北京中医药大学SPF级实验室饲养[SYXK(京)2011-0024]，自然光线，自由进食和饮水。适应性喂养1周后，状态良好，第2周开始实验，大鼠术前后12 h禁食不禁水。随机抽取16只作空白组对照观察，剩余全部造模。

1.3.1 动物造模 采用右侧纹状体双靶点定向注射6-羟基多巴胺制备PD大鼠模型。大鼠称重后，腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉,将大鼠头部固定于脑立体定位仪上,头部备皮消毒后，在右耳前做1.5 cm长的切口至暴露出前囟,确定前囟坐标。按照包新民、舒斯云主编的《大鼠脑立体定位图谱》[4]定位注射靶点坐标:①前囟前0.7 mm，中线右侧3.0 mm，硬膜下4.5 mm；②前囟后0.2 mm，中线右侧2.6 mm，硬膜下6.0 mm。用微型电钻按上述坐标钻孔。用5 μl微量注射器向脑内两个预定靶点分别以0.5 μL/min速度注入6-OHDA 15 μg，注毕留针10 min，以1 mm/min的速度缓慢退针，之后用明胶海绵填塞钻孔止血，缝合头皮，待动物清醒后放回,分笼保暖饲养。术后腹腔注射青霉素钠8万U/天，连续注射1周，防止感染。

1.3.2 模型评价 造模4周后腹腔注射0.01%的APO(0.5 mg/kg)诱发大鼠旋转行为，观察并记录大鼠旋转启动后60 min内的圈数，若稳定出现以左侧肢体(健侧)为支点，首尾相接并恒定转向左侧，且旋转圈数平均7圈/min以上者，视为PD大鼠造模成功，否则视为不成功模型[5]。造模成功率为86%，造模成功共48只。

1.3.3 分组和干预手段 造模成功后大鼠随机分成模型组、电针组、针刀组3组，每组16只。造模结束后1周进行干预，其中空白组、模型组动物正常饲养,只做观察。电针组：将大鼠俯卧固定于鼠板上，参照李忠仁主编的《实验针灸学》[6]取“百会”(位置在顶骨正中)；“太阳”(在大鼠眼外眦与耳之间连线近1/3处)，用0.25 mm×25 mm毫针针刺，接电针仪，疏密波，频率2～100 Hz交替，强度约1 mA，电压0.1 V,针刺强度以大鼠头部微颤为宜，留针20 min。每周3次，连续4周。针刀组：龙胆紫定位后常规备皮、消毒，选用0.4 mm×40 mm HZ系列一次性针刀，取C1、C2横突后结节处[7]松解，刀口线与脊柱方向平行，刀体与皮面垂直刺入，出刀后按压片刻止血。每周2次，连续4周。

1.4 行为学检测

4周治疗期结束后1周对各组大鼠进行APO诱导的旋转行为学观察，评价方法同前模型评价方法，评价后进行取材。

1.5 HE染色法光镜下观察黑质形态学

行为学评价结束后，次日每组大鼠取8只，用10%水合氯醛麻醉，经左心室4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注固定后取脑组织，分离并保留黑质，在4%多聚甲醛的磷酸缓冲液中固定1周，经脱水、透明、石蜡包埋，切取6 μm厚的冠状切片，行HE染色，观察组织形态学。

1.6 高效液相色谱-电化学法检测纹状体神经递质多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NA)、5-羟色胺(5-HT)含量

各组剩余大鼠水合氯醛麻醉后断头处死，冰盘上取脑，分离双侧纹状体液氮冻存；称重取定量脑组织，加入1 ml的标准液，置4℃冰浴中用超声波匀浆1 min， 4℃12000转/min离心15 min，取出上清液后加入0.1 mol/L的高氯酸0.5 ml，OSA 1ml，漩涡震荡3 min后4℃低速离心3000转/min ，3 min。除去有机相，在下层水相中加入高氯酸(HClO4)1 ml，经旋涡振荡3 min、低速离心3 min后,取上层水样直接进样，每次进样10 μL。设定色谱条件为：工作电极1∶150 mV、工作电极2∶450 mV、工作电极3∶500 mV、工作电极4∶550 mV，柱温：25℃。流动相：NaH2PO490 mmol/L，CA 50 mmol/L，OSA 1.7 mmol/L， EDTA 0.05 μmol/L。上述溶液以0.2 μm水系膜过滤，滤过液中加入乙腈(10%)，设置流速为：0.6 mL/min，在室温下进行，内标法定量分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 针刀干预对大鼠旋转行为学的影响

与空白组相比：模型组大鼠转圈数较空白组增加(P<0.01)；与模型组相比：电针组、针刀组大鼠转圈数减少显著(P<0.01)；与电针组相比：针刀组差异无统计学意义(P>0.05)。干预前后，空白组大鼠均不发生转圈行为改变；造模后大鼠出现旋转行为学改变，且模型组大鼠干预前后转圈数不发生变化；电针和针刀干预后大鼠转圈数均显著低于模型组，且针刀组转圈数要低于电针组，这表明电针和针刀干预都可以改善PD模型大鼠的转圈行为学，针刀干预效果优于电针干预。见表1。

表1 各组大鼠干预前后转圈行为学比较

注：与空白组比较，△△P<0.01；与模型组比较，**P<0.01

2.2 光镜下观察针刀干预对PD大鼠模型中脑黑质HE染色形态学的影响

空白组：神经元细胞数多、有序、形态正常,未见变性坏死，胶质纤维排列规整。模型组：神经元细胞数目显著减少,部分细胞见胞体肿胀,空泡变性,胶质细胞增生,炎性细胞浸润,胞核大小不一致。电针组：神经元细胞数目部分增加，胞体肿胀减轻，炎症细胞浸润减轻，胶质纤维排列欠佳。针刀组：神经元细胞数增加明显，形态接近空白组正常细胞，胞体肿胀减轻，胶质细胞增生减轻，胶质纤维排列较规整，电针组与针刀组差异不显著。见封三彩图1。

2.3 针刀干预对PD大鼠纹状体内神经递质含量影响

与空白组相比：模型组大鼠DA、NA、5-HT含量均显著降低(P<0.01)；与模型组相比：电针组NA、5-HT含量较模型组升高(P<0.05)，针刀组DA、NA、5-HT含量较模型组升高显著(P<0.01)；与电针组相比：针刀组DA、NA、5-HT含量未见统计学差异(P>0.05)。造模后，模型组大鼠纹状体神经递质DA、NA、5-HT含量均较空白组显著减少，电针和针刀干预后大鼠纹状体神经递质DA、NA、5-HT含量高于模型组，且针刀组DA、5-HT含量高于电针组，接近于空白组。结果表明，针刀和电针干预均可以改善PD模型大鼠纹状体内神经递质DA、NA、5-HT含量，且针刀干预的改善效果总体优于电针干预。见表2。

表2 各组大鼠干预后DA、NA、5-HT含量的比较

注：与空白组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

针刀治疗在帕金森病辅助治疗方面疗效确定，优势逐渐凸显，需要通过相关实验研究明确其作用机制。

本研究采用目前常用的PD动物模型造模方法之一：6-OHDA右侧纹状体定向注射法，直接损毁脑内特定的神经核团，引起多巴胺能神经元的不可逆损伤。造模技术成熟，成功率达86%，模型可靠。选择APO诱导的旋转行为做行为学评价[8]，外周给予多巴胺受体激动剂APO后，进入中枢使损伤侧的突触后膜DA受体激动，兴奋作用引起大鼠向健侧旋转，通过记录单位时间内的旋转圈数对PD的行为症状进行量化观察[9]。本实验表明针刀和电针干预均可减轻帕金森病模型大鼠行为学症状。光镜下见模型组神经元细胞减少和变性坏死明显，针刀和电针干预后神经元细胞变性坏死减轻，形态学变化表明针刀干预可以减轻帕金森病模型大鼠的黑质神经元变性缺失。

黑质-纹状体通路和帕金森病发病相关，其中联系纹状体部的3个主要神经元通路[10]为DA能通路、NA能神经、5-HT能通路。帕金森病典型病理生理改变是黑质-纹状体通路内多巴胺能神经元为代表的神经元变性缺失，细胞内α-突触核蛋白异常聚集。DA能神经元的胞体分布于黑质，轴突投射于纹状体[11]。神经元胞体分泌神经递质DA通过轴突释放到纹状体发挥效应。当DA能神经元变性缺失，直接引起纹状体部位神经递质DA含量的减少[12]。研究认为[13]黑质-纹状体内以DA为代表的单胺类神经递质含量减少是帕金森病的一个重要的神经生化改变，DA含量下降到70%左右就会出现帕金森病的核心症状-运动功能障碍，如静止性震颤、运动迟缓、肌强直等。NA能神经元中枢起于蓝斑区，神经纤维分布到纹状体、额叶前皮质和边缘系统。研究表明[14]，在PD状态下，纹状体部位递质NA含量有轻、中度减少， NA含量是临床诊断PD重要的生化指标之一[15]。5-HT主要来自于中缝核群中的5-HT能神经元，是纹状体中含量仅次于DA的单胺类神经递质。有资料表明[16]在PD患者纹状体内5-HT递质有一定减少。经过PD患者死后尸体解剖发现[17]，伴随壳核部的DA含量下降，尾状核部5-HT的相关物质(5-HT、5-羟色氨酸、5-羟色胺的转运体、色氨酸羟化酶等)有降低[18]，目前研究认为[19-21]5-HT能抑制造模后基底节回路中GABA引起的异常神经冲动，改善丘脑以及大脑皮质对运动的调节，改善PD的运动症状。有研究[22]通过脑涨落图技术对PD患者和正常对照者行脑内神经递质检查时，结果显示PD患者脑内神经递质DA、NA、5-HT等含量较正常对照减少。认为PD发病和患者纹状体内神经递质DA、NA、5-HT等单胺类神经递质含量减少有关。本研究成功造模后发现，模型组纹状体递质DA、NA、5-HT含量显著低于空白组(P<0.01)，与既往研究结果一致。

有研究表明合成DA等神经递质的原料主要来自于血液[23]。中脑黑质-纹状体区主要由大脑中动脉供血，受交感神经颈上节的支配。当交感神经颈上节受异常刺激会引起大脑中动脉异常，直接影响中脑黑质部血供和DA、NA、5-HT等神经递质的正常合成代谢。交感神经颈上节位于C1、C2横突水平，其后方临最长肌及其筋膜，前方覆有椎前筋膜[24]。针刀在C1、C2横突后结节处松解，可直接改善神经节周边肌腱、筋膜的紧张状态，减轻对其的异常刺激，改善大脑中动脉对黑质纹状体区的血供，有助于促进DA、NA、5-HT等神经递质合成。本实验针刀干预后，大鼠行为学转圈数减少较模型组和电针组显著,电针和针刀干预后DA(P<0.01)、NA(P<0.05)、5-HT(P<0.01)含量较模型组升高显著，表明针刀通过松解颈部软组织，可改善大脑中动脉对黑质纹状体区的血供，升高纹状体部DA、NA、5-HT等神经递质的含量。

针刀疗法以微创的方式调整软组织异常状态，对软组织病变及其影响下的神经、血管、骨关节及内脏器官功能异常都有治疗作用[25]。本实验以新型微创疗法针刀为干预手段，通过观察大鼠行为学变化、黑质形态学变化、纹状体相关神经递质含量变化，探讨了针刀疗法通过局部松解间接调节脑神经递质含量而发挥对帕金森病的治疗作用机制,是对帕金森病治疗新方式和治疗机制的新探索。

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ImpactofBehaviorandNeurotransmitterinPDRatsbyAcupotomyIntervention

XUJing1,LUJuan1,GUOYan1,LIANGJing-rong1,MAWei-wei1,LUSheng-chun2,GUOChang-qing1△

(1.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2.DexingShengchunHospital,Dexing334224,China)

Objective：To observe effect of the acupotomy intervention on behavior and striatum neurotransmitters, such as contents of DA, NA, and 5-HT in PD rats.Methods16 SD rats(male) were randomly selected into the blank control group; the rest rats were modeled into PD rats with the method of right striatum double target injection, the PD rats were randomly divided into the model group, the electro-acupuncture group, and the acupotomy group. The rats in the electro-acupuncture group were needling on GV20 and EX-HN5, three times a week; acupotomy was used to debonding transverse processes of C1and C2, twice per week. After four-week observation period, behavior changes were assessed by rotation test triggered by APO; morphological changes of substantia nigra were observed with HE staining method under light microscope; the content of DA, NA, and 5-HT were detected with HPLC-ECD.ResultsIn terms of the rotation test, the rats in the blank control group did not rotate; the rotation in the model group showed no change; the rotation was significantly decreased after electro-acupuncture intervention and acupotomy intervention, when compared to the model group(P<0.01). In terms of the content of DA, NA, and 5-HT, they significantly became lower in the model group when compared to the blank control group(P<0.01); they were obviously increased after acupotomy intervention(P<0.01, orP<0.05).ConclusionAcupotomy intervention can alleviate behavioral symptoms and increase the contents of DA, NA, and 5-HT these striatum neurotransmitters when treating PD in rats.

Acupotomy therapy; Behavior study PD; Neurotransmitter; HPLC-ECD

R246.6

A

1005-0779(2017)11-0058-04

江西德兴市胜春医院课题(横向课题)，编号:535104032。

徐菁(1990-)，女， 2015级针灸推拿学专业硕士研究生。

△

郭长青(1959-)，男，教授,博士研究生导师，研究方向：针刀理论与临床研究。

2017-06-26