硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠苗期生长及生理指标的影响

明佳佳, 殷红清, 朱云芬, 李卫东, 陈大清, 杨永康, 杨朝东, 陈菲菲,李亚杰, 叶紫云, 万海英, 龙 澜, 问小龙, 向极钎*

1.恩施州硒应用技术与产品开发研究院, 湖北 恩施 445000; 2.仲恺农业工程学院生命科学院, 广州 510225; 3.长江大学湿地生态与农业利用教育部工程研究中心, 湖北 荆州 434000

硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠苗期生长及生理指标的影响

明佳佳1, 殷红清1, 朱云芬1, 李卫东1, 陈大清2, 杨永康1, 杨朝东3, 陈菲菲1,李亚杰1, 叶紫云1, 万海英1, 龙 澜1, 问小龙1, 向极钎1*

1.恩施州硒应用技术与产品开发研究院, 湖北 恩施 445000; 2.仲恺农业工程学院生命科学院, 广州 510225; 3.长江大学湿地生态与农业利用教育部工程研究中心, 湖北 荆州 434000

以恩施堇叶碎米荠幼苗作为实验材料，采用实验大棚基质栽培，以硒酸钠(Na2SO4)作为硒源，设置7个处理组(CK：0 mg/kg；A1：12.5 mg/kg；A2：25 mg/kg；A3：50 mg/kg；A4：100 mg/kg；A5：200 mg/kg；A6：400 mg/kg)，模拟了恩施矿区从低硒到高硒胁迫环境对堇叶碎米荠苗期生长及生理特性的影响。结果表明：低硒A2处理条件下植株生长状况较好，而高硒A6处理条件下植株叶片微卷、叶脉突出，生长受到抑制；随着施硒浓度增加，堇叶碎米荠根、茎、叶中硒含量呈现显著的增加趋势，且最高含量分别达到1 517 mg/kg、5 531 mg/kg、4 340 mg/kg；随着施硒浓度增加，与CK组相比，在A6处理条件下叶片中丙二醛(MDA)含量增加了134%，谷胱甘肽(GSH)含量降低了128%，而脯氨酸(Pro)含量无显著变化。总体而言，恩施堇叶碎米荠幼苗适宜在硒含量25 mg/kg的基质中生长，基质中的硒含量不宜超过400 mg/kg。研究结果为堇叶碎米荠幼苗培养及种植提供了科学数据基础。

堇叶碎米荠；硒酸钠；苗期生长状况；生理指标

恩施堇叶碎米荠(CardamineviolifoliaO. E. Schulz)为十字花科多年生草本植物，其野生资源主要分布在湖北恩施、宜昌和湖南壶瓶山一带，植株在海拔800 m以上生长较好，其耐胁迫能力较强，可以生长在旱地、溪水、超硒、镉离子浓度较高的环境中[1]。有研究发现，湖北恩施双河矿区碎米荠根、茎、叶中分别可累积硒高达8 000 mg/kg、2 000 mg/kg及2 300 mg/kg，这也是目前所发现的对硒累积能力最强的植物[2]。碎米荠也具有较高的药用价值，早在唐代孟洗的《食疗本草》、陈士良的《食性本草》中均记载其具有利便、止痛功效，且在1978年湖北省卫生厅颁布的《湖北中草药志》和1987年出版的《中国植物志》中也都记录了碎米荠全草可用作妇女补虚药,还有止咳化痰、活血、止泻等功效[1]。

硒是人和动物的必需微量元素之一，参与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的合成，具有清除体内自由基、抗衰老的作用[3]。适量的硒可以增加植物组织中的硒含量[4]，提高作物产量，改善作物品质[5]，增加其对干旱[6]、盐害[7]、冻害[8]、重金属毒害[9～11]等逆境胁迫的抵抗能力；也有研究表明，适量的硒可以提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等的活性，降低植物体内丙二醛(MDA)的含量，提高体内谷胱甘肽(GSH)的含量[11～14]，减少由逆境胁迫所产生的质膜过氧化累积，增加体内还原性物质的含量，提升其抗逆能力。但是过量的硒也会对人与动物产生毒害，导致人和动物因硒中毒而出现脱发、掉指甲等现象。“世界硒都-恩施”有着大面积的富硒区，同时也存在小面积的硒矿区[15]，这里硒含量超标，严重影响了植物的生长，制约着当地经济的发展，而堇叶碎米荠作为高聚硒植物，对硒有较强的耐受性，可以作为植物硒源提取材料，具有较高的经济价值。碎米荠栽培对环境要求较高，幼苗人工栽培难度更大，需要科学规划指导，而目前尚无相关研究。本研究以超聚硒植物恩施堇叶碎米荠为材料，模拟硒矿区超硒含量标准，研究硒酸钠对不同硒环境下碎米荠苗期生长状况及生理特征变化的影响，以期为人工规模化栽培恩施堇叶碎米荠提供科学依据。

1 材料与方法

1.1试验材料与试验设计

试验材料采用大棚基质栽培，以硒酸钠(Na2SO4)作为硒源，种子为恩施堇叶碎米荠，待种子发芽2～3周后移栽。试验设置7个处理，分别为CK(0 mg/kg)、A1(12.5 mg/kg)、A2(25 mg/kg)、A3(50 mg/kg)、A4(100 mg/kg)、A5(200 mg/kg)、A6(400 mg/kg)。植株移栽后生长3个月，随后进行采样，每个处理组采5株叶片并用去离子水冲洗，叶片样品用液氮保存，转移至-80℃冰箱，待测。

1.2试验方法

1.2.1生长参数 植株移栽后生长3个月，随后进行采样，每个处理组采5株，先用自来水冲洗，再将样品带回实验室用去离子水冲洗2～3次后擦干，用尺子分别测定植物株高和根长，最后分别对不同部位称重、装袋、烘干、再称重、研磨、过筛(60目)、装袋。

1.2.2硒含量测定 将1.2.1中根、茎、叶样品进行硒含量测定，测定方法参照马作江等[16]改进。样品经微波消解仪消解后，用等离子体质谱(ICP-MS)测定样品硒含量。

1.2.3叶片中GSH、MDA含量测定[13]测定MDA和GSH使用的缓冲液相同，即称取0.5 g植物叶片样品，加入5%三氯乙酸研磨均匀，转移至10 mL离心管，离心后的上清液即为提取液，然后按照反应体系利用比色法分别测定叶片中GSH和MDA的含量。

1.2.4叶片中脯氨酸(Pro)含量的测定[17]①标准曲线制作：配制脯氨酸浓度分别为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL的标准液，制作标准曲线。

②脯氨酸的提取：称取不同处理待测植物叶片0.5 g，然后加入3%磺基水杨酸溶液5 mL，在沸水浴中加热10 min，冷却后过滤于干净试管中，滤液为脯氨酸提取液，然后按照反应体系利用比色法测定脯氨酸含量。

1.3数据统计

数据统计分析用Microsoft Excel、SigmaPlot 10.0、SPSS 20.0软件进行。

2 结果与分析

2.1硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠苗期生长状况的影响

观察7个处理组的生长状况(图1)，从图中对比可知，与对照组CK相比，A1、A2、A3处理组的植株壮硕、叶片舒展、叶色葱绿，长势较好，而A4、A5和A6处理组植株矮小、叶片微卷、叶脉突出，有明显的中毒症状。从各组植株的生长参数测量结果(表1和表2)可以看出，与对照组CK相比，A2处理组显著提高了茎、叶、整株的鲜重以及叶的干重和株高，分别增加了55.38%、43.51%、40.24%、27.49%、46.86%；A6处理组显著降低了根、茎、整株的鲜重和根长，以及根、叶、整株的干重，其中根的鲜/干重、茎和整株的鲜重分别下降了64.42%、52.66%、44.73%、44.78%；随着施硒浓度增大，植物鲜重、干重、株高、根长均呈现降低趋势，且A6处理组达到最低。

图1 硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠苗期生长状况的影响Fig.1 Effects of selenium stress on the growth of C. violifolia.注：CK：0 mg/kg；A1：12.5 mg/kg；A2：25 mg/kg；A3：50 mg/kg；A4：100 mg/kg；A5：200 mg/kg；A6：400 mg/kg。

表1 硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠及其根、茎、叶(鲜重)、株高的影响Table 1 Effects of selenate stress on root,stem,leaf,the total plant(fresh weight),height of C. violifolia.

注：每个处理组取样5株，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表2 硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠及其根、茎、叶(干重)、根长的影响Table 2 Effects of selenate stress on root,stem,leaf,the total plant(dry weight),root length of C. violifolia.

注：每个处理组取样5株，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠苗期组织中硒含量的影响

从硒在碎米荠各部位含量分布(图2)可以看出，苗期碎米荠硒累积效果茎>叶>根；根、茎、叶中硒含量均随着硒处理浓度增加而显著升高，且根、茎、叶中最高硒含量分别达到1 517 mg/kg、5 531 mg/kg、4 340 mg/kg；与其他处理组相比，A5和A6处理组的植物茎叶中硒增幅较大，且这2个处理组在叶片中的硒含量没有显著性差异。

2.3硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠苗期组织生理指标(MDA、GSH、Pro)的影响

图3显示了7个处理组的植株叶片中MDA、GSH、Pro的含量，可以看出，与CK组相比，碎米荠叶片中MDA含量在A1、A2、A3处理时无显著变化，但随着硒处理浓度增大而显著升高；与CK组相比，A1处理组的GSH含量升高了17.3%，而与MDA趋势相反的是，叶片中GSH含量在A3处理组后随着硒处理浓度增加而呈显著降低趋势，但A5和A6处理组无显著差异；在施硒处理中，Pro在叶片中的含量无显著性差异，唯有A4处理时下降了43.30%。

3 讨论

硒是人和动物必需的微量元素，也是植物生长的有益元素。微量元素硒一般以硒酸盐、亚硒酸盐、有机硒(硒氨基酸等)的3种形式被植物根和叶片吸收，在植物体内主要以硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸的形式存在，且参与谷胱甘肽过氧化物酶的合成，增加其酶合成量及活性[18]。本研究模拟了恩施硒矿区不同硒浓度环境下堇叶碎米荠的生长状况，发现高硒处理组(A6)严重抑制了植物生长，导致植株矮小、茎分蘖数减少、叶片小而微卷、主叶脉突起严重、叶色失绿、根较短、不定根分蘖较少且细小，严重影响了根对营养物质的摄取，根、茎、叶的鲜、干重显著降低，这与重金属重度毒害表现[19]相似，表明高浓度硒酸钠(400 mg/kg)处理对堇叶碎米荠的苗期生长具有明显的毒害作用。向天勇等[20]在不同浓度外源硒的添加对碎米荠生长发育影响的研究中发现，硒处理浓度在30 mg/L以下会促进其干物质累积；付小丽[21]研究表明，适量外源硒可以促进小麦和油菜的生长以及干物质的累积。有研究表明，随着外源硒处理浓度增加，植物体内硒含量也呈增加趋势[4,21,22]，这与本研究结果相似，但是本研究中碎米荠硒累积效果呈现茎>叶>根，且最高硒含量达到了5 531 mg/kg，这是一般植物无法达到的硒累积浓度。

硒作为植物有益元素之一，可提高作物产量[23]、改善品质[24]，还可增加抗旱[6]、抗寒[8]、抗辐射[25]、缓解重金属毒害[10,11,26]、抗病[13,27]等抗逆境胁迫能力；机理上可以调节内环境离子平衡，提高相关酶(SOD、POD、CAT、GSH-Px等)活性，调节非酶类物质(MDA、GSH、ASA等)含量[17,28]。MDA作为细胞质膜过氧化指标之一，本研究中A4、A5和A6处理时显著增加了碎米荠叶片中MDA的含量，可能是由于硒处理浓度增加，破坏了植物体内的代谢平衡，从而使植物的质膜过氧化作用增强，尤其是A6处理导致叶片中MDA含量较对照组CK增加了134%，严重影响了植物生长。GSH作为植物体内还原性物质，同时是GSH-Px的下游产物，而硒是合成GSH-Px的必需物质之一，适量的硒可以促进GSH-Px合成，提高酶的活性，但是过量硒可能会破坏植物体内的代谢平衡。本研究结果中，相比CK组，A1处理组的叶片中GSH含量提高了17.3%，且A6处理组的叶片中GSH含量减少了128%，这可能是高浓度硒处理下影响了GSH-Px合成的诱导信号，从而破坏了植物体内的环境平衡，致使GSH累积量减少；而A1、A2处理组的植物叶片中GSH含量增加均未达到显著性差异，这可能是由于超聚硒植物堇叶碎米荠为硒不敏感植物，生长在低浓度硒环境中并未影响到其生理变化，在高硒环境时才表现出相应的生理调节。比较特别的是，脯氨酸的累积与植物受伤害程度呈显著正相关[29]，但本研究结果中硒处理浓度的增加并没有导致脯氨酸过量累积，且在A4处理时呈降低趋势，这可能与该植物体超聚硒能力及其他生理生化平衡有关，高浓度硒处理对碎米荠体内抗氧化酶及硒参与体内代谢相关酶(ATP硫酸化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、硒代半胱氨酸甲基转移酶等)的影响有待进一步研究。

图2 硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠根、茎、叶中硒含量的影响Fig.2 Effects of selenate stress on selenium content of the root,stem,leaf of C. violifolia.注:同组数据中不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图3 硒酸钠胁迫对堇叶碎米荠叶片中MDA、GSH、Pro含量的影响Fig.3 Effects of selenate stress on MDA,GSH,Pro content in the leaf of C. violifolia.A.MDA含量;B:GSH含量;C:Pro含量。同一图中不同字母表示差异显著(P<0.05)。

综上所述，本研究模拟硒矿区不同硒浓度对堇叶碎米荠生长及生理指标的影响，低浓度硒处理(A2，20 mg/kg)有利于促进碎米荠生长及其各干物质累积；高浓度硒处理(A6，400 mg/kg)会严重抑制植物生长及干物质累积，显著增加植物体内MDA含量并降低了GSH含量，所以A2处理组浓度(20 mg/kg)是堇叶碎米荠苗期生长的适宜硒浓度。

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硒应用技术与产品开发研究团队介绍

硒研究院现有科研人员44人，其中正高职称13人，副高职称10人，博士2人，硕士研究生20余人，研究领域涵盖化学、植保、食品、药学、土化、畜牧、植物学、微生物、生物技术等多个专业。设立种植富硒标准化、养殖富硒标准化、聚硒植物筛选、聚硒微生物、富硒功能性食品、硒检测方法研究等多个学科。每年承担国家、省、州多个硒科研项目。

EffectsofSelenateStressontheGrowthandPhysiologicalIndexesofCardamineviolifoliaO.E.SchulzDuringSeedlingStage

MING Jiajia1, YIN Hongqing1, ZHU Yunfen1, LI Weidong1, CHEN Daqing2, YANG Yongkang1, YANG Chaodong3, CHEN Feifei1, LI Yajie1, YE Ziyun1, WAN Haiying1, LONG Lan1, WEN Xiaolong1, XIANG Jiqian1*

1.EnshiInstituteofSeleniumApplicationTechnologyandProductDevelopment,HubeiEnshi45000,China；2.CollegeofLifeScience,ZhongkaiUniversityofAgricultureandEngineering,Guangzhou510225,China；3.EngineeringResearchCenterofEcologyandAgricultureUseofWetland,MinistryofEducation,YangtzeUniversity,HubeiJingzhou434025,China

The seedling plants ofCardamineviolifoliaO. E. Schulz were used as experimental materials to investigate the effects of selenate (Na2SO4) application on the growth and physiological indexes during seedling stage, and seven levels (CK：0 mg/kg; A1：12.5 mg/kg; A2：25 mg/kg; A3：50 mg/kg; A4：100 mg/kg; A5：200 mg/kg; A6：400 mg/kg) were set up. The results showed that the suitable Na2SO4level was A2 treatment and the toxic symposium could be observed with slight roll leaves,veins prominentand inhibited growth under A6 level. With the increasing of Na2SO4application, the concentrations of Se in roots, stems and leaves were significantly increased up to 1 517 mg/kg, 5 531 mg/kg, 4 340 mg/kg, respectively. Under A6 level, the MDA contents in leaves increased by 134%, the GSH contents in leaves decreased by 128% and Pro contents in leaves was no significant changes. Overall, the present study revealed that the seedling plants ofCardamineviolifoliaO. E. Schulz could grow better under about 25 mg Se/kg medium, but be toxic under 400 Se/kg medium, which provided reference for cultivation ofCardamineviolifoliaO. E. Schulz.

CardamineviolifoliaO. E. Schulz; selenate; seedling growth; physiological index

2017-08-03;接受日期2017-08-24

国家自然科学基金项目(31560579)；国家科技支撑计划项目(2015BKA226)资助。

明佳佳，助理农艺师，主要从事硒与农产品分析检测研究。E-mail:641390495@qq.com。*通信作者：向极钎，正高级农艺师，主要从事生物技术与植物提取研究。E-mail:2416861638@qq.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0100