紫外分光光度计法测定茶叶中邻苯基苯酚的含量

2017-11-23刘楠囡李秀华

福建茶叶 2017年12期

陈迪，刘楠囡，林雯，陈哲，林峰，马艳，李秀华，

（1.福州出入境检验检疫局，福建福州 350001；2.福建师范大学化学与化工学院，福建福州 350108；3.漳州出入境检验检疫局，福建漳州 350006；4.闽江师范高等专科学校化学与生物工程系，福建福州 350000）

陈迪1，刘楠囡2，林雯3，陈哲4，林峰1，马艳1，李秀华2，1

为建立茶叶中的邻苯基苯酚含量的测定方法，利用甲醇:水(7:3)作为萃取剂,萃取方法选择超声波萃取法，萃取出茶叶中的邻苯基苯酚，采用紫外分光光度法，建立邻苯基苯酚标准曲线对其进行含量测定。对萃取剂，缓冲液，最适宜pH值等条件进行优化。优化后的邻苯基苯酚浓度与吸光度具有良好线性关系，线性相关系数为0.994，加标回收率在90.1%～91.2%之间，证明该方法切实可行。该研究为通过超声波萃取结合紫外分光光度法能够测定茶叶中邻苯基苯酚，并且该方法具有准确度高，反应灵敏，操作简便等优点。

茶叶；超声波提取法；邻苯基苯酚；紫外分光；标准曲线

食品的三大机能：营养学特性、嗜好性感官品质特征、对人体的调节技能或保健机能。茶叶是为数不多的同时具备这三大机能要求的完美食品。茶不仅能够带给人们味觉的享受，还能够促进人们的身体健康，种种好处使得茶受到越来越多人的欢迎。饮茶、品茶已经成为人们生活中不可缺少的一部分。随着茶叶风靡全球，越来越多人开始重视茶叶的质量和安全问题。但是在茶叶的生长过程中，为了杀虫除菌、提高增产率，不可避免的会使用到农药，农药会残留在茶叶上极难清除，也不可避免的会对环境和人类健康产生危害或者有潜在的威胁。有资料显示，中国的茶树除了有机茶被限制不能喷洒农药，99%的茶树都或多或少的喷撒了农药。现在世界上有近30亿人饮用茶，世界各地都有种植茶叶和茶叶进出口贸易，在如此大的需求面前，许多国家制定的农药残留相关法规并没有那么完善，大部分国家只标明了茶叶中农药残留的最大标准，而并不是禁止农药残留的存在。同时各个国家对茶叶的农药残留相关的法律法规也不统一，例如，欧洲因为地域气候关系不适合种植茶叶，同时对食品的安全卫生要求更高，因此它对茶叶农药残留的标准最严格，而中国的产茶量和出口量居世界领先，但由于国外贸易壁垒日趋严格，导致了中国茶叶的出口量减少[1]，主要原因是因为中国关于茶叶农药残留量的指标还未完善[2]。这几年茶叶农残相关国家标准不断更新出台，可见茶叶中农药残留问题越来越受到重视[3]。

近五年，欧盟对茶叶相关法规进行了多达69次修订，茶叶农残标准限制对象已经从茶园中使用的一般农药扩展到草甘膦等除草剂，再到蒽醌、多氯酸盐等环境污染物。最近出口欧盟的茶叶中又查出邻苯基苯酚这一防腐杀菌剂，邻苯基苯酚是一种能够致癌的物质，对肾脏会产生毒副作用，危害人体健康，因此迫切需要建立一种高效，快捷的方法来测定茶叶中邻苯基苯酚。邻苯基苯酚，又叫做2-羟基联苯(ortho-phenylpheno，简称OPP)，一般为白色片状或块状，具有一定生物毒性。邻苯基苯酚具备良好的杀菌杀毒能力，是常用的防腐剂之一，一般都用在对果蔬类的防腐和保鲜，或者是用于纺织品、橡胶制品、化妆品等当中的消毒剂和防腐剂。目前，OPP残留检测的主要方法有液相色谱法[4-7]、气相色谱法或气相色谱-质谱法[8-10]。色谱法分析成本高，色谱仪价格及日常维护费用贵，分析时间一般比较长。而紫外检测器是最普遍的检测途径，大部分物质在液体状态下都有紫外检测光谱，其吸光值和其浓度呈现一定的线性关系，且不同的物质的紫外峰基本都是唯一峰，并且紫外分光光光度法适合大众能够做到的检测方法，它还拥有分析成本低、紫外检测仪价格及日常维护费用低、准确度高、使用方便等优点。

茶叶中因含有大量的营养物质和化合物，增加了茶叶前处理的难度。而茶叶的前处理是整个分析过程的重要步骤，高效快速的提取方法更是茶叶中农药残留分析的核心，直接影响后期检测方法的准确度。因此农药残留分析茶叶的前处理要求提取率高，尽量少用或不用有机溶剂[11]，以减少污染。常见的样品前处理方法主要有干法灰化法、固相萃取法、超声波提取法等[12-14]，通过查阅文献[15-20]，本实验采用超声波萃取法作为茶叶的前处理方法。超声波提取法是利用超声波强化提取作用，即媒质产生独特的机械振动作用和空化作用，机械振动作用将超声波的能量传递给样品，使组分脱附和溶解加快；空化作用使分子运动加快[21]。超声波提取法操作简单，并且它拥有操作简便、提取效率高，可克服常规方法的被测成分在多次转移中损失，从而影响检测准确性的缺点。近年来超声波提取法在茶叶的前处理中有着广泛应用[19-21]。

本文将专门讲述先用甲醇：水，甲醇，乙醇溶液分别为提取试剂，并采用超声波萃取来提取茶叶中的邻苯基苯酚，结合紫外分光光度计分析在不同缓冲液中，不同pH值下邻苯基苯酚的最大吸收峰并绘制标准曲线，通过计算加标回收率确定方法的准确性。从而建立了一种快速简便地检测茶叶中邻苯基苯酚含量的方法。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

1.1.1 试剂

2-苯基苯酚，Rd，Nanqiao Twon，Fengxian Shanghai，China；甲醇，AR，国药集团化学试剂有限公司；乙醇，AR，国药集团化学试剂有限公司；茶叶，西湖龙井，浙江省杭州市1.1.2 仪器设备

紫外可见分光光度计，UV1901PC，上海棱光技术有限公司；电子天平，ML104/02，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超声波清洗器，KQ3200E，昆山市超声仪器有限公司

2 结果与讨论

2.1 最佳溶剂（萃取剂）的选择

邻苯基苯酚微溶于水，因此选择了三种不同极性的溶剂[22-23]（甲醇：水，甲醇，乙醇）来进行比较选出最佳溶剂。

称取邻苯基苯酚，在其他制备条件保持不变的前提下，使用三种不同溶剂：甲醇：水（7:3）、甲醇、乙醇分别配制6 μg/mL，分别以不同溶剂作为空白进行基线的确定，在190～400 nm波长范围内多次进行光谱的连续扫描，并作出紫外峰来进行比较。可知甲醇：水（7:3）紫外吸收峰最好，并采用其作为溶液的溶剂（萃取剂）。实验结果可知，甲醇：水（7:3），甲醇，乙醇三种萃取剂的标准溶剂吸收曲线峰形一致，在其他条件不变的是情况下，甲醇：水（7:3）溶剂的紫外峰最大吸收波长处的吸光值最好，更故采用甲醇：水（7:3）作为样品的萃取剂。

2.2 OPP紫外检测方法优化

2.2.1 OPP最大吸收波长的选择

吸取2 μg/mL的OPP溶液于比色皿中，以甲醇：水（7:3）溶剂作为空白进行基线的确定，在190～400 nm波长范围内多次进行光谱的连续扫描，如图（1），以确定OPP的最大吸收波长。

图（1）最大吸收波长的确定

由图（1）可知，邻苯基苯酚在190～400 nm范围内，在201.0、283.5 nm波长处均有吸收峰，其中以201.0 nm处的吸收峰最强，无杂峰干扰且较为稳定，适合作为最大吸收波长进行实验。

2.2.2 OPP适宜缓冲液的选择

在三组6 μg/mL的OPP溶液分别加入pH=8.5的不同的缓冲液（BR缓冲液，PBS缓冲液，醋酸缓冲液），分别加入于比色皿中，以甲醇：水（7:3）溶剂作为空白进行基线的确定，在其他制备条件保持不变的前提下，在190～400 nm波长范围内多次进行光谱的连续扫描，通过其紫外峰的最大吸收峰来确定最适宜的缓冲液。实验结果可知，三种不同缓冲液（BR缓冲液，PBS缓冲液，醋酸缓冲液）对于OPP标准液的影响的不同程度，其中醋酸缓冲液所得吸光值最大，但因其最大吸收波长处也导致偏离，故选用BR缓冲液作为OPP溶液的适宜缓冲液。

2.2.3 OPP最适宜缓冲液pH值的选择

通过查阅文献可知[24]，在酸性条件下,pH对OPP的紫外吸收影响不大，故在 6μg/mL 的 OPP 溶液中加入 pH 值为 6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10 的 BR 缓冲液，并测其最大吸收峰。根据不同pH值测得的吸光度绘制pH值与吸光度的变化关系。得出6 μg/mL OPP标准溶液在不同pH值下BR缓冲液的吸光值，可知OPP标准溶液在pH=7.5下的吸光值最好。

2.3 OPP标准曲线的绘制

从上述 OPP 储备液（200.0 μg/mL）标准溶液中精确吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1mL 定容于 10mL 容量瓶，配制 2、4、6、8、10、12、20 μg/mL 质量浓度的标准溶液。从2 μg/mL标准溶液中吸取5mL定容于10mL容量瓶中配制1μg/mL溶液。从20μg/mL标准溶液中吸取 0.1、0.25、0.75mL定容至 10mL容量瓶中配制 0.2、0.5、1.5μg/mL 溶液。从1μg/mL 标准溶液中吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2mL 定容至 10mL 容量瓶中配制 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12μg/mL溶液。标准溶液均用甲醇：水（7:3）定容，采用最佳缓冲液的pH值，并在最大吸收波长处进行紫外扫描得出OPP标准曲线并计算出线性相关系方程如图（2）。

图（2） OPP标准曲线

测定不同浓度邻苯基苯酚标准品溶液在最大吸收波长处的吸光值，绘制标准曲线图（2），可知邻苯基苯酚浓度与吸光度没有呈直线关系，通过分析，取lgC为横坐标，A为纵坐标，并拟合得到回归方程：y=0.3x+1.505，线性相关系数为0.994。由图（2）可以看出当标准溶液质量浓度在0.02～12μg/mL范围内，邻苯基苯酚标准曲线的线性关系良好。说明使用该曲线测定待测样品的邻苯基苯酚含量具有较高的准确性。

2.4 样品的预处理与测定

2.4.1 样品的预处理

称取0.1g茶叶样品，碾碎于离心瓶中加入甲醇：水（7：3）萃取剂10mL，在超声波清洗器中超声提取20分钟，将萃取剂倒出在10mL烧杯中备用。

2.4.2 样品的测定和样品加标回收率的测定

提取超声后的萃取剂0.1 mL稀释至10 mL,加入BR缓冲液，以甲醇：水（7:3）溶剂作为空白进行基线的确定，作出样品的紫外峰与OPP标准溶液的紫外峰图进行比较。

量取上述稀释后样品溶液均匀液体试样5 mL，装入比色皿中在最大波长处进行紫外扫描，确定空白样品中OPP的含量。然后分别量取3份均匀液体试样5mL，加入5 mL质量浓度为 0.5、2、8 μg/mL的OPP溶液。以甲醇：水（7:3）溶剂作为空白进行基线的确定，采用最佳缓冲液的PH值，在最大波长处进行紫外扫描。每组回收率测定3次，取平均值进行计算，计算结果如表1所示，由此可见，其加标回收率范围在90.1%～91.2%，回收率在正常范围内，符合加标回收率的标准，证明方法是可行的。

表一 OPP加标回收率测定结果

1.3.4 干扰物实验的测定

为确定茶叶中是否有其他物质干扰影响实验结果的测定，分别配制儿茶素、咖啡因、维生素C 6μg/mL，取1mL装入比色皿中，作出三种物质的紫外吸收峰，和OPP标准溶液的紫外峰图进行比较，观察是否对最大波长处的吸收峰有影响。实验证明上述物质对该检测方法均无干扰。

3 总结

本实验建立了茶叶中的邻苯基苯酚含量的测定方法，具有准确性和稳定性。利用甲醇:水（7:3）作为萃取剂，萃取方法选择超声波萃取法，萃取出茶叶中的邻苯基苯酚，并采用紫外分光光度法，建立邻苯基苯酚标准曲线对其进行含量测定，对标准曲线的萃取剂，缓冲液，最适宜pH值等条件进行优化。在在0.02～12μg/mL范围内，邻苯基苯酚浓度与吸光度具有良好线性关系，其相关系数为0.994，加标回收率在90.1%～91.2%之间，符合加标回收率的标准，证明方法是可行的。结论为通过超声波萃取结合紫外分光光度法能够测定茶叶中邻苯基苯酚，并且该方法具有准确度高，反应灵敏，操作简便等优点。

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