miR-126对结肠癌细胞生物学行为的影响及其在调控结肠癌EMT转化中的作用①

魏海峰 米旭光 刘 磊 芦小单 李首庆 谭 岩 方艳秋

(吉林省人民医院医学诊治实验中心，长春 130021)

·生物治疗·

miR-126对结肠癌细胞生物学行为的影响及其在调控结肠癌EMT转化中的作用①

魏海峰 米旭光 刘 磊 芦小单 李首庆 谭 岩 方艳秋

(吉林省人民医院医学诊治实验中心，长春 130021)

目的观察miR-126在不同转移潜能的人结肠癌细胞系中的表达情况及其对结肠癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响并探讨可能的作用机制。方法采用实时荧光定量PCR检测结肠癌细胞系(SW480、SW620及HCT116)中miR-126的表达量。通过脂质体瞬时转染法将miR-126过表达(miR-126 mimics)，并设置阴性对照组，然后采用CCK8法检测细胞的增殖能力，细胞划痕实验检测细胞的迁移能力，Transwell侵袭小室实验检测细胞的侵袭能力，Western blot实验检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达量的变化。结果相对于低转移潜能的结肠癌细胞株SW480，miR-126在高转移潜能的SW620和HCT116细胞中的表达降低。过表达miR-126可使SW620细胞增殖、迁移和侵袭能力降低，E-cadherin蛋白表达增加，Vimentin蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论低表达的miR-126与结肠癌的转移密切相关，miR-126影响结肠癌细胞生物学行为的作用可能是通过调控EMT进程实现的。

miR-126；结肠癌；上皮细胞-间充质转化；肿瘤生物治疗

结肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，发病率也正逐年升高。早期结肠癌患者通过手术治疗预后较好，但是晚期患者的5年生存率仅有20%左右，治疗效果不佳，其死亡的主要原因是肿瘤的转移[1]。结肠癌的转移机制非常复杂，这一过程涉及癌细胞的上皮-间质转换、侵袭黏附能力、血管生成等作用[2,3]，其中上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移的关键启动步骤，在结肠癌进展中发挥着主导作用。然而，EMT相关信号通路涉及多个分子、多条信号通路，任何针对单个分子的干预方法，都难以达到理想的逆转效果。因此，有必要寻找新的手段和策略。最近研究表明，miRNA可以通过负性调控EMT相关基因的表达，在肿瘤转移中起着重要的作用[4,5]。到目前为止，仅有少数miRNA被证实参与了肿瘤EMT的发生，miRNA在肿瘤尤其是结肠癌EMT中所起的作用及其分子机制还远未阐明。本研究通过观察miR-126的过表达对结肠癌细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭的影响及EMT相关蛋白表达的变化，观察miR-126在结肠癌转移复发中的作用并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 人结肠癌细胞株SW480、SW620及HCT116为本实验室冻存；胎牛血清、RPMI medium 1640、DMEM培养基(Gibco，美国)；Trizol、LipofectamineTM2000(Life Technologies，美国)；Has-miR-126 mimics及阴性对照Cel-miR-67 mimics(上海百奥迈科，中国)；miR-126、U6引物(上海生工，中国)；RT-PCR试剂盒(Promega，美国)；SYBR Green Master(Roche，瑞士)； Matrigel基质胶、Transwell小室(Coming公司);CCK8试剂(北京碧云天公司);E-cadherin、Vimentin及GAPDH抗体(Santa Cruz公司)。其他常规试剂产自北京化工。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 用含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的RPMI1640在37℃、5%CO2的培养箱中培养，常规换液、传代。

1.2.2脂质体转染 按照LipofectamineTM2000说明书进行操作，用于转染的细胞，在转染前一天选取对数生长且状态良好的细胞，胰酶消化，以1×105个/孔接种细胞数接种至6孔细胞培养板中。转染当天细胞丰度可达60%～70%。每孔转染miRNA mimics 5 μl(终浓度为50 nmol/L)，转染后48 h，留取细胞、提取RNA或蛋白用于后续实验。

1.2.3总RNA提取和qRT-PCR检测 Trizol法提取结肠癌细胞株总RNA。紫外分光光度计测量纯度和浓度。按逆转录说明书将1 μg RNA逆转录为cDNA。将得到的cDNA 5倍稀释用于荧光定量PCR反应。使用2×SYBR Green Master在ABI7500荧光定量PCR仪上测定。miRNA表达以U6作为内参。引物序列：hsa-miR-126:颈环引物5′-GTCGTA TCCAG TGCAG GGTCC GAGGT ATTCG CACTG GATAC GACCG CATT-3′，miR-126-3p forward primer:5′-GTCTC GTACC GTGAG TAAT-3′，miRNA Universal primer:5′-GTGCA GGGTC CGAGGT-3′；U6 forward primer:5′-CTCGC TTCGG CAGCA CA-3′，reverse primer:5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′。以2-ΔΔCt法计算每组细胞miR-126的表达量。

1.2.4CCK-8实验 细胞以5×103个/孔接种于96孔板，连续培养4 d后，每孔加入10 μl CCK8试剂与90 μl培养液，培养箱内反应2 h后，酶标仪测定在490 nm处波长的吸光度(A)，每组设6个复孔，计算平均值，重复实验3次。

1.2.5细胞划痕实验 将细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，培养箱中孵育培养，待细胞长满至80%时，用10 μl微量移液头消毒后在细胞板上垂直划痕，PBS洗涤细胞3次，去除脱落的细胞，加入无血清培养基。于实验第1天及培养48 h后倒置显微镜下观察各组细胞的迁移情况。

1.2.6Transwell侵袭实验 接种前2 h用无血清培养基稀释Matrigel胶，以50 μl/孔的体积铺于小室上，放置于培养箱内2 h，细胞饥饿24 h后调整浓度为5×105ml-1，上室接种200 μl细胞悬液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养液。继续培养24 h后取出Transwell小室，弃去孔中培养液，FBS洗涤，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，用棉签擦去上室Matrigel胶和未穿过膜的细胞，PBS清洗、干燥。倒置显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数，计算平均值，重复实验3次。

1.2.7Western blot实验 提取细胞总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入目标蛋白一抗4℃孵育过夜，与辣根过氧化酶标记二抗室温反应、孵育后，利用胶片曝光、显影、定影，图像分析仪行胶片扫描，分析灰度值。

2 结果

2.1不同结肠癌细胞中miR-126的表达水平 如图1所示，相对于结肠癌细胞株SW480，miR-126在结肠癌细胞SW620和HCT116中的表达明显更低。

2.2结肠癌细胞SW620转染miRNA mimics后miR-126的表达情况 以脂质体LipofectamineTM2000转染miR-126 mimics入SW620细胞中，终浓度为50 nmol/L，Cel-mir-67 mimics为阴性对照(Negative control,NC)，以U6为内参。数据以2-ΔΔCt方式表示。实验结果显示(图2)，转染miRNA mimics 48 h后，可使低表达miR-126的结肠癌细胞株SW620中此miRNAs的表达显著上调(P<0.01)。

图1 miR-126在不同结肠癌细胞中的表达差异Fig.1 Expression of miR-126 in different colon cancer cells

图2 结肠癌细胞SW620转染miRNA mimics 后miR-126的表达Fig.2 Expression of miR-126 in colon cancer cell SW620 after mimics transfectedNote: Compared with NC group，**.P<0.01.

2.3过表达miR-126对细胞增殖的影响 CCK8法结果显示：随着培养时间的延长，过表达miR-126组结肠癌细胞SW620的增殖能力从第3天后开始比阴性对照组下降，至第4天时差异有统计学意义(P<0.05)，表明miR-126具有抑制结肠癌细胞SW620增殖的能力(图3)。

2.4划痕实验检测miR-126对细胞迁移能力影响 对结肠癌细胞SW620进行划痕处理后，48 h后观察细胞的迁移情况，阴性对照组及miR-126 mimics转染组划痕区域相对宽度分别为(44.67±2.34)%及(62.47±3.16)%。miR-126 mimics转染组划痕细胞断端的距离较阴性对照组显著宽大，差异有统计学意义(P<0.05)，表明miR-126可抑制SW620细胞的迁移能力。

图3 miR-126 mimics对结肠癌细胞SW620增殖能力的影响Fig.3 Effect of miR-126 mimics on proliferation of colon cancer cell SW620 after mimics transfectedNote: Compared with NC group，*.P<0.05.

图4 Western blot检测SW620细胞E-cadherin和Vimentin蛋白表达Fig.4 Expression of E-cadherin and Vimentin protein in SW620 cells

2.5Transwell小室检测miR-126对细胞侵袭能力影响 Transwell小室结果显示，miR-126 mimics转染组穿过滤膜迁移至下室的细胞个数为(74.00±6.58)个，较阴性对照组(186.40±9.74)个显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)，表明miR-126具有抑制结肠癌SW620细胞侵袭的作用。

2.6Western blot检测细胞E-cadherin和Vimentin蛋白表达情况 Western blot结果显示(图4)，与阴性对照组相比，miR-126 mimics转染组SW620细胞E-cadherin的表达增加，而Vimentin表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，是导致上皮来源的恶性肿瘤细胞发生侵袭和转移的关键步骤，因此研究结肠癌EMT发生的分子机制，寻找可以逆转结肠癌EMT的重要分子靶点，在关键步骤对结肠癌转移进行干预，理论上可更有效抑制结肠癌转移。然而，EMT相关信号通路涉及多个分子、多条信号通路，任何针对单个分子的干预方法，都难以达到理想的逆转效果。因此，有必要寻找新的手段和策略。由于单个miRNA可以同时调控多个靶基因的表达，靶向miRNA的干预理论上能更有效地逆转肿瘤。例如ZEB1 和ZEB2 已被多名研究者证实为miR-200家族的直接靶基因，在其3′-UTR区域存在多个可被miR-200家族成员互补结合的位点，外源性过表达miR-200c 可以下调ZEB1 的表达进而促进上皮细胞标志分子E-cadherin 的表达，从而抑制肿瘤EMT的发生[6-8]。

miR-126同样作为一种“抑癌性miRNA”，已在多项研究中证实其在正常组织中高表达、肿瘤组织中低表达[9,10]。本研究组前期工作亦证实，miR-126在结肠癌组织中较正常结肠组织和癌旁组织表达降低，且和淋巴结转移具有明显联系，提示miR-126可能在结肠癌的复发和转移中具有重要的作用。结肠癌细胞株SW480是一种低转移潜能的细胞系，而SW620和HCT116为高转移潜能的细胞系。研究已证实，不同转移潜能的细胞系亦具有明显的EMT表型差异。因此本研究首先观察了不同转移潜能的细胞系中miR-126的表达差异，结果证实相对于低转移潜能的结肠癌细胞SW480，miR-126在结肠癌细胞SW620和HCT116中的表达明显更低。对miR-126低表达的SW620细胞转染miRNA mimics后，发现可以抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力，进一步提示miR-126在结肠癌的发生发展中具有重要的作用。

本研究结果还表明：miR-126可以促进SW620细胞E-cadherin的表达增加，降低Vimentin的表达，提示过表达miR-126有助于抑制结肠癌EMT的发生。EMT的发生发展涉及多条信号通路，例如RhoA信号通路、EGFR/PI3K/Akt信号传导通路参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管生成，通过EMT调控方式参与肿瘤细胞侵袭和转移[11,12]。低表达的miR-126可能通过负调控相关靶基因，激活信号通路，促进EMT的发生，加速结肠癌的转移和复发，具体机制有待于进一步研究。

综上，结肠癌中miR-126的低表达可能存在高转移及复发风险，miR-126抑制结肠癌细胞SW620增殖、迁移及侵袭的机制可能是通过抑制EMT过程实现的，miR-126可能成为新的结肠癌分子预警标志和新的治疗靶点。

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[收稿2017-07-11]

(编辑 张晓舟)

RoleofmiR-126ineffectofbiologicalbehaviourandepithelialtomesenchymaltransition(EMT)inhumancoloncancercells

WEIHai-Feng,MIXu-Guang,LIULei,LUXiao-Dan,LIShou-Qing，TANYan,FANGYan-Qiu.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To investigate the expression of miR-126 in human colon cancer cell lines with different metastatic potential and its effect on the proliferation,invasion and metastasis of colon cancer cells,and to explore the possible mechanism.MethodsThe expression of miR-126 in human colon cancer cell lines (SW480,SW620 and HCT116) was determined by Real-time fluorescence quantitative PCR.miR-126 mimics were transiently overexpressed in SW620 cells throuIgh liposome transfection and the negative control group was set up.The proliferation ability of cells was detected by CCK8 method and the mobility of cells was detected by wound healing assay and Transwell migration and invasion assay.The expression of E-cadherin,Vimentin was determined by Western blot.ResultsThe expression of miR-126 was decreased in SW620 and HCT116 cells with high metastatic potential compared SW480 cells with low metastatic potential.The overexpression of miR-126 significantly inhibited the proliferation,migration and invasion ability of SW620 cells and Western blot indicated that miR-126 overexpression increased the expression of E-cadherin and decreased the expression of Vimentin in SW620 cells,which was significantly different from that of negative control(P<0.05).ConclusionLow expression of miR-126 is closely related to metastasis of colon cancer and the effect of miR-126 on the biological behavior of colon cancer cells may be mediated by the regulation of the EMT process.

miR-126；Colon cancer；EMT；Tumor biological therapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.012

①本文受吉林省科技厅自然科学基金(20150101178JC)、吉林省人社厅省人才开发资金(2016年度)和吉林省科技厅重点实验室建设专项基金(20160622008JC)资助。

R392R730.5

A

1000-484X(2017)11-1658-04

魏海峰(1978年-)，男，博士，助理研究员，主要从事肿瘤基础及方面的临床研究,E-mail：whfweb@163.com。

及指导教师：方艳秋(1968年-)，女，博士，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事肿瘤生物治疗基础与临床方面的研究,E-mail：yq.fang@163.com。