斑秃患者Th17、Th22及其细胞因子水平的变化及意义

贺燕妮 ，范晴 ，张彤 ，杜凌波 ，朱瑞政 ，曾义斌 ，庞艳花 ，汪五清

（1．上海闵行区中心医院，上海 201199；2．上海交通大学附属第六人民医院南院，上海201499）

·论著·

斑秃患者Th17、Th22及其细胞因子水平的变化及意义

贺燕妮1，范晴2，张彤1，杜凌波1，朱瑞政1，曾义斌1，庞艳花1，汪五清1

（1．上海闵行区中心医院，上海 201199；2．上海交通大学附属第六人民医院南院，上海201499）

目的探讨斑秃患者Th17、Th22及其细胞因子水平的变化及意义，从免疫学方面分析T淋巴细胞在是否在斑秃发病机制中发挥作用。方法随机选取我院皮肤科于2016年1月—2016年10月收治的斑秃患者38例，为观察组；随机选取同期健康体检者38例，为对照组，采用流式细胞仪检测Th17及Th22表达水平，用酶联免疫吸附法检测白细胞介素（IL）－22及IL－17水平，比较2组受试者Th17、Th22及其细胞因子水平。结果观察组血清Th17、Th22表达水平均高于对照组（P＜0．05）；观察组 IL－22、IL－17 水平均高于对照组（P＜0．05）；脱发面积和 Th17、Th22 及其细胞因子表达水平均呈正相关（P＜0．05）。结论斑秃患者外周血中Th17、Th22及其相关细胞因子表达水平均高于健康对照者，本研究将为斑秃的诊疗与预后评估方面提供一定参考。

斑秃；Th17；Th22；白细胞介素－17；白细胞介素－22

斑秃（Alopecia areata，AA）是表现为局限性斑片状脱发,具有慢性炎症性质的疾病，容易复发，任何毛发部位均可受累，年轻人多发。目前本病病因不明，但研究发现，其发病可能与神经精神因素、免疫功能异常、内分泌障碍和遗传因素等相关[1]。多数学者认为，本病是以毛囊为靶器官，T淋巴细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病[2]。为进一步探讨Th17、Th22及其细胞因子在斑秃患者外周血中的表达及意义，本研究收集了斑秃患者与健康体检者的血清进行对比研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取我院皮肤科在2016年1月—2016年10月收治的斑秃患者38例，所有患者均符合《中国临床皮肤病学》诊断标准，入选前2个月内未接受全身皮质类固醇激素、免疫抑制剂等药物治疗，均在患者的知情同意下进行，并经过我院伦理委员会的批准。无假性秃发、先天性秃发、孕妇、严重心肾功能疾病、精神病者。男20例，女18例，年龄 18～55 岁，平均（36．12±6．12）岁；12 例全秃者，26例局限性斑秃者。随机选取同期至我院进行体检的健康者38例，通过体检及实验室检查各项指标均正常。男24例，女14例，年龄18～56岁，平均（37．21±6．05）岁。2 组在性别、年龄上差异无统计学意义（P＞0．05），有可比性。

1.2 检测方法

1.2.1 仪器与试剂 FACS Calibur型流式细胞仪及配套试剂盒：美国BD公司；人白细胞介素（IL）－22 ELISA试剂盒以及人IL－17 ELISA试剂盒：上海博华生物科技有限公司。

1.2.2 外周血单个核细胞培养 所有患者及体检者于清晨空腹抽血，外周血加入用肝素钠抗凝，离心，去除血浆后充分混匀；吸取4 mL淋巴细胞分离液置入10 mL的离心管内，将离心管倾斜，沿离心管壁缓慢注入全血，尽量不让血液进入淋巴细胞分离液中。以1 700转/min离心30 min后，取出离心管中间的白膜层，将其转移至另1个离心管内，加入磷酸盐缓冲液（PBS）充分混匀，以1 800转/min离心15 min洗涤后，加入培养液，混匀。吸取200 μL细胞混悬液，装入孵育板中，置于37℃恒温箱培养4 h。

1.2.3 Th17及Th22的流式细胞仪检测 4 h后取出孵育板，吸取细胞混悬液，装入流式管，加入PBS缓冲液吹打混匀，以1 200转/min离心5 min，洗涤1遍。去除上清液，加入50 μL破膜剂，加入1μL的IL－17及IL－22的荧光标记抗体，混匀，置于4℃冰箱内保存，备用。24 h后，采用流式细胞仪进行检测，采用 Flowjo（V7．6．2）软件对数据进行分析。

1.2.4 IL－17、IL－22酶联免疫吸附实验 取足量酶标包板，固定于框架上，设置3孔，分别为标准品孔（50 μL 标准品）、待测样本孔（40 μL 稀释液+10 μL待测样本）以及空白对照孔（不加任何物质），置于恒温箱中30 min。取出酶标包板，待干燥后，加入稀释后的洗涤液，1 min后，甩去洗涤液。除空白对照孔外，其余2孔各加入50 μL酶标工作液，置于恒温箱中30 min，再次洗板，每1孔内各加入50 μL显色剂A液以及50 μL显色剂B液，均匀混合，置于恒温箱中15 min。取出酶标包板，每1孔内加入50 μL终止液。采用450 nm波长酶标仪检测每孔内的吸光值。

1.3 观察指标 观察并记录2组受试者外周血中Th17、Th22 及 IL－17、IL－22 的表达水平，测定并计算患者的脱发面积。

1.4 统计方法 采用SPSS19．0软件进行数据处理，Th17、Th22及其细胞因子的表达水平均采用（±s）表示，2个均数比较用t检验，相关性采用一元线性回归法分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Th17与Th22细胞水平 流式细胞术检测结果示，对照组和观察组Th17细胞占外周血CD4+T细胞比例分别为（1．21±0．24）%和（2．98±0．87）%，差异有统计学意义（P＜0．05），见图 1。全秃患者和局限性斑秃者Th17占外周血CD4+T细胞比例分别为（3．64±2．32）%和（2．17±1．14）%，与对照组相比差异均具有统计学意义（P＜0．05），见图 2。对照组和观察组Th22细胞占外周血CD4+T细胞比例分别为（1．48±0．28）%和（3．63±1．19）%，差异有统计学意义（P＜0．05）。全秃患者和局限性斑秃者 Th17占外周血 CD4+T 细胞比例分别为（4．33±1．48）%和（3．11±1．12）%，与对照组相比差异均具有统计学意义（P＜0．05）。

2.2 外周血IL－22、IL－17的表达水平比较 观察组患者外周血中IL－17及IL－22表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0．05）；与局限性斑秃患者相比，全秃患者外周血中IL－22和IL－17水平进一步升高（P＜0．05），见表 1。

图1 流式细胞术检测斑秃患者和正常对照组外周血中Th17细胞所占比例变化

图2 流式细胞术检测斑秃患者和正常对照组外周血中Th22细胞所占比例变化

表1 外周血IL-22、IL-17的表达水平比较

2.3 外周血 IL-17、IL-22、Th17、Th22 百分比与脱发面积的相关性 采用一元线性回归分析法发现，观察组外周血中IL-17与脱发面积呈正相关（r=0.432，P<0.05），IL-22 与脱发面积呈正相关（r=0.569，P<0.05）；Th17与脱发面积呈正相关（r=0.326，P<0.05）,Th22与脱发面积呈正相关（r=0.326，P<0.05）。

3 讨论

现代研究认为，斑秃是由T淋巴细胞介导的具有器官特异性的自身免疫性疾病，毛球周围T淋巴细胞浸润是其主要病理特征之一[3]。Th17细胞是最早由Park等[4]在自身免疫性脑脊髓炎和胶原诱导性关节炎的研究中发现的CD4+T细胞的亚群，此细胞亚群的分化与Th1和Th2细胞都不相同。Th17细胞可以特异性分泌 IL-6、IL-17、IL-21、IL-22 以及TGF-α等细胞因子，从而发挥其生物学效应。据国外研究发现，斑秃患者病灶处毛囊周围可找到IL-17浸润，提示斑秃的发生可能与毛囊周围浸润的细胞产生了IL-17，引起自身免疫应答有关[5-6]。Th22细胞,是最新发现的Th细胞亚群，其效应与其他CD4+T细胞亚群相似。Th22细胞不仅能够诱导其他细胞的分化，并且还参了与T细胞亚群的极化过程，调节自身免疫疾病的免疫应答，参与皮肤病理状态的发展。Th22细胞除主要分泌IL-22外，还可分泌 IL-10、IL-13、IL-26、TNF-α 等细胞因子，其主要功能是通过IL-22来实现的。Th22细胞可诱导补体经典激活途径和旁路途径中的因子活化，启动补体应答通路，可能具有促进机体固有免疫和适应性免疫应答的作用。研究表明，Th22细胞参与多种自身免疫性疾病的发生、发展，如：类风湿性关节炎、红斑狼疮、银屑病等疾病[7]。通常Th22细胞与其他的细胞亚群可相互调控，从而使得机体处于相对平衡的状态。

目前，对于斑秃患者的外周血CD4+CD25+Treg细胞、TGF-β1等的研究较多，但对于Th17、Th22及其细胞因子水平在斑秃患者中的表达研究较少[8-10]。本研究发现，斑秃患者的外周血中Th17、Th22细胞及其相关细胞因子的表达均高于对照组患者，且随着患者病情的严重程度，表达亦增高，呈正相关。

综上，斑秃患者外周血中Th17、Th22及其相关细胞因子表达水平均高于健康对照者，但这些因子的变化是原发因素还是继发因素，尚待进一步研究，本研究将为斑秃的诊疗与预后评估方面提供一定参考。

[1]王侠生．杨国亮皮肤病学[M]．上海:上海科学技术文献出版社,2005:748-749．

[2]周静,丁杨峰,杨勤萍.T细胞因子在斑秃发病中的作用[J].中国皮肤性病学杂志,2010,24（1）:23-26.

[3]陈小敏,杨秀丽,史维,等.斑秃患者外周血CD4+CD25+Foxp 3调节性T细胞及T淋巴细胞亚群的测定 [J].中华皮肤科杂志,2008,41（1）:29-31.

[4]Park H,Li Z,Yang XO,et al.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17[J].Nat Immunol,2005,6:1133-1141.

[5]Tanemura A,Oiso N,Nakano M,et al.Alopecia areata:infiltration of Th17 cells in the dermis,particularly around hair follicles[J].Dermatology,2013,226:333-336.

[6]Tojo G,Fujimura T,Kawano M,et al.Comparison of interleukin-17-producing cells in different clinical types of alopecia areata[J].Dermatology,2013,227:78-82.

[7]蔡泽明,赵莹,张斌,等.早期斑秃皮损处炎症细胞因子及凋亡因子的异常表达[J].中华皮肤科杂志,2015,48（2）:128-131.

[8]张小婷,赵莹,张斌,等.斑秃皮损的炎症浸润和毛囊周期改变特征[J].广东医学,2013,34（6）:867-871.

[9]隋佳佳,陈晓红,方宁,等.斑秃患者外周血CD4+CD25+Treg细胞计数及TGF-β1的表达[J].中国皮肤性病学杂志,2012,26（6）:492-495.

[10]陈颖,张秀明.Th22细胞生物学功能及临床应用的研究进展[J].实用医学杂志,2012,28（17）:2970-2972.

Role of Th17 Cells,Th22 Cells and Their Relative Cytokines in the Pathogenesis of Alopecia Areata

He Yanni1,Fan Qing2,Zhang Tong1,Du Lingbo1,Zhu Ruizheng1,Pang Yanhua1,Wang Wuqing1
1.Shanghai Minhang District Central Hospital,Shanghai 201199,China;2.Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital South Campus,Shanghai 201499,China

ObjectiveIn order to determine the frequency of Th17 cells,Th22 cells and expression of their related cytokines in peripheral blood of patients with alopecia areata （AA）,and investigate their significance,as well as explore the role of T lymphocytes in the occurrence of AA．MethodsA total of 38 patients with AA were enrolled from our hospital from January 2016 to October 2016,and served as the case group．At the same time,38 healthy people were taken as the control group．Peripheral blood samples were obtained from these patients and controls．Flow cytometry was performed to determine the percentage of Th17 cells,Th22 cells,and enzyme－linked immunosorbent assay （ELISA）was used to measure serum levels of interleukin （IL）－22 and IL－17．ResultsCompared with the control group,the case group showed significant increasing percentages of Th17 cells,Th22 cells （P＜0．05）,as well as serum levels of IL－17 and IL－22（P＜0．05）．Conclusion Th17cells,Th22 cells and their related cytokines may participate in the occurrence,development and prognosis of AA．

Alopecia areata;Th17;Th22;Interleukin－17;Interleukin－22

R758．71

A

1672－0709（2017）05－0385－04

上海市闵行区自然科学研究课题（2015MHZ017）

汪五清，E－mail：wuqingw2006@sina．com

2016-09-08）