副猪嗜血杆菌病诊断与耐药分析

霍元楠，蒋增海*，，王宇坤，谢倩倩，张彦兵

(1．河南牧业经济学院，动物医学院，河南 郑州 450046；2．河南省猪病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046）

副猪嗜血杆菌病诊断与耐药分析

霍元楠1，2，蒋增海*，1，2，王宇坤1，2，谢倩倩1，2，张彦兵1，2

(1．河南牧业经济学院，动物医学院，河南 郑州 450046；2．河南省猪病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046）

2017年3月，河南省清丰县某猪场育肥猪发生咳嗽、腹式呼吸、体温升高等症状，为确诊病因，采集典型病猪的肺、心血，分离出一种细菌，通过染色镜检、氧化酶触酶试验和PCR分子鉴定，最终确定出分离菌为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)，编号为qff01。选择14种药物，采用纸片扩散法，对已确定为副猪嗜血杆菌的分离菌株进行药敏试验，其结果表明分离菌株对头孢噻呋钠、阿莫西林-克拉维酸、恩诺沙星、头孢曲松、阿奇霉素等药物敏感，对氨苄西林、四环素、氯霉素、土霉素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶耐药。本研究结果对该猪场的副猪嗜血杆菌病防治工作提供了一定的参考依据。

副猪嗜血杆菌；分离鉴定；药敏试验

副猪嗜血杆菌属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是引起猪的格拉泽氏病(Glasser's Disease)的病原菌[1]，可以引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，给养猪业造成巨大的经济损失。根据猪健康状况和菌株毒力的高低，副猪嗜血杆菌，可以造成急性或者慢性的感染，尤其对早期断奶仔猪造成较大的危害。随着我国猪场的规模化和集约化进程的加快，副猪嗜血杆菌病已成为当前的流行趋势，很多地区都有对该病的报道[2]。

2016年3月，河南省清丰县某猪场，饲养基础母猪150头，存栏3月龄育肥猪约1 000头，自从2月1日发生严重流感以后，多数圈舍的猪已恢复，还剩下少数圈舍猪还未康复，表现为严重的腹式呼吸，呼吸频率加快，咳嗽，体温升高到40.5～41 ℃，采食稍有减少，体况正常，皮肤发白；剖检病变为心包积液（图1），肺实质性变硬，气肿，肺脏肉变、胰腺样变（图2），表面散在出血点，气管内存在有大量泡沫性黏液，肺脏与胸膜黏结，肠系膜淋巴结肿大，肝脏胆汁充盈。用药情况，强力霉素肌注给药，氟苯尼考加替米考星拌料，一直不见好转。为了诊断与控制该病，选取典型病例，进行了副猪嗜血杆菌分离、鉴定及药敏试验，现报告如下。

图1 剪开心包膜，出现明显的心包积液现象

图2 肺表面散在出血点，实质性变硬，出现肉变、胰腺样变

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，胰酪胨大豆肉汤（TSB)购自BD公司，配制时，加入终浓度为5%的新生牛血清（购自杭州天杭生物技术股份有限公司），同时加入终浓度为10μg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)量（购自Roche公司，使用前需过滤除菌）；5%鲜血琼脂平板购自于江门市凯林贸易有限公司。

1.1.2 药敏片

头孢噻呋，头孢曲松，氨苄西林，头孢他啶，阿莫西林-克拉维酸，氨曲南，四环素，土霉素，恩诺沙星，环丙沙星，氯霉素，磺胺甲恶唑/甲氧苄啶，阿奇霉素，克林霉素，均购自oxoid公司。

1.1.3 PCR材料

琼脂糖（Low EEO MμLti-purpose Agarose）购自HydraGene公司；2×Taq PCR Master mix缓冲液购自Genview公 司；DL2000 DNA Marker由Taksps公司提供；参考文献[3]根据副猪嗜血杆菌16SRNA序列设计引物，PCR扩增预片段为822 bp大小；上游引物：5'-GGCTTTCGTCACCCTCTGT-3'；下游 引 物 ：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'。

1.1.4 其他试剂

快速革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；金黄色葡萄球菌由河南牧业经济学院预防兽医传染病实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 分离培养

无菌采集患猪肺部组织、心血，分别接种于已添加NAD和犊牛血清的TSA培养基，37 ℃培养24～48 h，观察其生长情况，挑取疑似副猪嗜血杆菌单个菌落，进一步纯化2～3代。

1.2.2 涂片镜检

从TSA平板上，挑取上述可疑单菌落，均匀涂抹于洁净的载玻片上，自然干燥，火焰固定后，进行革兰氏染色，油镜下观察形态。

1.2.3 卫星生长现象

挑取可疑单个菌落，水平划线接种于鲜血琼脂平板上，再在该平板上垂直划线接种金黄色葡萄球菌落，37 ℃培养24～48 h，观察是否有卫星生长现象和溶血现象。

1.2.4 接触酶反应

挑取疑似HPS菌落加入到6%H2O2，观察是否有气泡产生。

1.2.5 PCR鉴定

挑取纯培养的两个单菌落洗脱于含200μL无菌去离子水中，涡旋均匀后，煮沸10 min立即放入-20 ℃冰箱冻融10 min，12 000 r/min离心3 min，取上清液作DNA模板。反应体 系 ：PCR Master Mix 12.5μL， 上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，灭菌的双蒸水9.5μL，模板2μL。反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性50 s，59 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖进行凝胶1×TAE缓冲液中电泳。

1.2.6 药敏试验

挑取TSA平板上纯化培养物，接种于含有NAD的胰蛋白大豆肉汤（TSB）中，37 ℃培养24～48 h。用TSB肉汤稀释菌悬液至0.5麦氏度，用灭菌棉签蘸取菌液，均匀涂抹于TSA培养基，用无菌的镊子夹取药敏片平贴于培养基表面，在37 ℃恒温箱培养24 h，测定抑菌圈直径。

2 结果

2.1 分离、培养

采集肺脏组织、心血接种于TSA平板，37 ℃恒温培养24～48 h，生长为大小0.5～2 mm、无色、透明、湿润、光滑的圆形菌落，进一步纯化2～3代后，菌落形态未见改变（图3），与已报道的文章[4]形态一致。

图3 分离菌在TSA上生长，出现针尖样大小，湿润光滑透明

2.2 涂片镜检

将可疑菌落，涂片，染色、镜检，可见细菌为革兰氏阴性，菌体表现多形态，细小杆菌，短杆菌，稍微弯曲，长丝状，或者以单个散在纤细杆状者居多（图4）。

图4 分离菌在油镜下观察，可见细菌为革兰氏阴性，出现细小杆菌，短杆菌，稍微弯曲，长丝状，或者以单个散在等多种形态

2.3 触酶反应结果

挑取疑似HPS菌落加入到6 %H2O2，立即产生大量气泡。

2.4 卫星生长现象

在血琼脂平板上出现明显的卫星现象，离葡萄球菌菌苔越近其菌长势越好，菌落越大，可见许多圆形，针尖大小，边缘整齐的菌落。远离葡萄球菌菌苔越远，菌落则越少、越小，甚至无菌落生长（图5）。推断出葡萄球菌周围有利于副猪嗜血杆菌的生长［5］。

图5 卫星现象，三条粗实线为接种的金黄色葡萄球菌，可见离葡萄球菌越近，分离菌长得越好，越远则只有少量菌落生长，甚至无菌落生长

2.5 PCR鉴定结果

PCR产物在凝胶电泳成像仪中可观察到约822 bp的DNA片段，以DL2000Marker为标准。可见待测样品与预期片段大小相符合（图6）。

图6 分离菌PCR结果

表1 药敏试验结果

2.6 药敏试验结果

由于副猪嗜血杆菌目前还没有判断标准，本试验根据参考文献[6]中，流感嗜血杆菌药物判定标准，进行判定。药敏试验结果表明本株副猪嗜血杆菌对头孢噻呋钠、阿莫西林-克拉维酸、恩诺沙星、环丙沙星等兽用药敏感；同时对头孢曲松、阿奇霉、氨曲南、头孢他啶、克林霉素等人用药均敏感；但是对氨苄西林、四环素、氯霉素、土霉素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶耐药（见表1）。

3 分析与讨论

根据本病流行特点、临床症状、病理变化和细菌分离与鉴定结果，将本次病例确诊为副猪嗜血杆菌病。由于副猪嗜血杆菌十分娇嫩，对环境和营养要求苛刻，临床病料分离HPS有一定的难度，进行细菌分离时，常需要新鲜病料，适宜的培养条件和富含营养的培养基，才能提高其临床分离率，本试验在TSA、TSB培养基中，添加了犊牛血清、NAD，适合于副猪嗜血杆菌分离、培养。

目前该病的防治措施主要包括预防接种、药物防治和加强饲养管理。疫苗免疫接种是预防副猪嗜血杆菌的有效方法之一。然而其血清型复杂，目前已知有15个血清型，但国内各地流行的血清型不尽相同［7］，且各型之间缺乏交叉保护，因此，临床上一般使用药物来防控该病。根据本次药敏试验结果，建议使用阿莫西林-克拉维酸、头孢噻呋或者恩诺沙星对该猪场病例进行治疗，根据养殖户反馈，治疗效果较好。

药敏试验结果表明，副猪嗜血杆菌分离株对兽医临床上常用药物：氨苄西林、四环素、土霉素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶均耐药，虽然氯霉素是动物禁用药物，但是对该药物仍然耐药，估计与同类药物氟苯尼考长期在猪场使用有关，进一步解释了养殖户使用氟苯尼考等药物控制不住疫情的原因。

因此，在日常管理中，合理使用抗生素，减少其耐药的产生，保持良好的饲养管理，加强通风，免疫接种当地流行毒株，搞好环境卫生，避免混合感染，实行全进全出的策略，可以减少该病发生的概率。

[1] OLIVEIRA S，PIJOAN C.Haemophilus parasuis：new trends on diagnosis，epidemiology and control[J].Veterinary Microbiology，2004，99(1)：1-12.

[2] 蔡旭旺，刘正飞，陈焕春，等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J].华中农业大学学报 ，2005，24(1)：55-58.

[3] OLIVEIRA S，GALINA L，PIJOAN C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2001，13(6)：495-501.

[4] 陆国林，何海健.浙江省副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国兽医科学 ，2010，40(6)：622-625.

[5] 薛国聪，徐成刚，涂玉蓉，等.副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国畜牧兽医 ，2010，37(1)：134-137.

[6] 孙长贵.2013年CLSI+M100-S23文件中文版[J].中华检验医学杂志，2013（1）：96-99.

[7] 周斌，储岳峰，李超，等.华东地区副猪嗜血杆菌的分离、血清型鉴定与药敏分析 [J]. 畜牧与兽医 ，2009，41(11)：84-86.

河南牧业经济学院预防兽医学重点学科建设项目（项目编号：MXK2016102）；

霍元楠（1994-），女，河南信阳人，本科，主要从事猪病临床诊断与防治研究；

蒋增海（1976-），男，四川简阳人，讲师，E-mail:50242328@qq.com。

2017-07-11)