阴离子型芘基探针用于水体中对硝基苯胺的荧光检测

葛文奇+圣迎迎+乔亚东+曹忠+吴海臣+姚志轶

摘 要 本研究利用阴离子型芘衍生物8羟基芘1，3，6三磺酸三钠盐（HPTS），建立了一种快速、可视化的对硝基苯胺（PNA）荧光检测方法。检测原理主要是基于PNA通过非共价作用而导致的HPTS的荧光淬灭。通过测量加入PNA后HPTS在512 nm处荧光强度的变化，可以实现PNA的荧光检测。本方法的线性范围为10～120 μmol/L，检出限（3σ/s）为4.6 μmol/L。对本方法的抗干扰性以及方法的实际应用性进行了考察。结果表明，本方法具有低成本、高灵敏度、高选择性、操作简便等优点。

1 引 言

苯胺及其衍生物是一类重要的化工原料与药物中间体，被广泛应用于农药，橡胶，高分子，染料及药物等化学品的生产过程中[1，2]。该类化合物的过度使用与排放已经对环境，特别是水体，造成了很大程度的污染。对硝基苯胺（pNitroaniline，PNA）是一种特殊的苯胺衍生物，具有很高的化学毒性，可以通过吸入、口服、皮肤接触等多种方式产生毒害作用，诱发缺氧、黄疸、贫血等疾病[3～5]。在印染、医药、油漆等行业中，PNA常被用作化工原料或中间体，可通过多种途径进入生态环境。由于PNA難降解，在环境中容易发生蓄积，已成为一种典型的有机污染物[6]。因此，发展PNA的快速、特异、PNA低成本的检测方法具有重要意义。

目前所报道的PNA分析方法包括高效液相色谱法[7]、气相色谱法[8]、气相色谱质谱法[9]， 电化学分析法[10，11]、分光光度测定法[12，13]、基于纳米材料的荧光检测法[14]、抑制荧光动力学法[15]等。其中， 色谱法是PNA检测的国家标准方法，具有较高的准确度； 电化学分析法需要对电极进行修饰，依靠待测物在电极上的氧化还原反应进行检测。尽管这些方法特点鲜明，但仍然存在一些问题，例如依赖于大型仪器的样品前处理过程繁琐、测试周期较长、灵敏度与特异性较低等，而纳米材料制备的重复性和较大毒性也在很大程度上限制了方法的应用。为解决以上问题，本研究采用商业化的阴离子型芘衍生物8羟基芘1，3，6三磺酸三钠盐（8Hydroxypyrene1，3，6trisulfonic acid， trisodium salt，HPTS），建立一种简单、快速、可视化的PNA荧光检测法。芘及其衍生物是一类性能优异的荧光传感材料，具有良好的化学稳定性、高的量子产率和较长的荧光寿命[15～18]，但繁琐的合成过程和较差的水溶性是限制芘基荧光探针应用的主要因素。HPTS作为一种特殊的芘基荧光探针，除了具有上述特点外，还具有良好的水溶性及低廉的成本[19]。 An等利用HPTS与阳离子型聚噻吩的非共价相互作用制备了一种荧光淬灭的超分子聚集体，并用于检测表面活性剂[20]； Rochar等利用咖啡因对HPTS荧光的淬灭，建立了一种咖啡因的荧光检测法[21]。上述方法均利用了HPTS超高的量子产率和和优异的水溶性，具有简便灵敏的特点。本研究利用市售的HPTS作为探针，通过HPTS与PNA之间的非共价相互作用对水体中的PNA进行测定。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

U3900型紫外可见分光光度计（日本Hitachi公司）； Scientific Fluorolog3型分子荧光光谱仪（HORIBA）； FE20型pH计（上海梅克勒仪器公司）； BS124分析天平（北京赛多利斯仪器公司）。

8羟基1，3，6芘三磺酸三钠（北京华威锐科有限公司）； KNO3、Ca（NO3）2、Mg（NO3）2、NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaNO3、NaH2PO4、苯胺、硝基苯、对氨基苯甲酸、对硝基苯胺（阿拉丁试剂有限公司）； 组氨酸、赖氨酸、精氨酸、对氨基苯酚（国药集团化学试剂有限公司）； 对甲氧基苯胺、对氨基氟苯（百灵威公司）。

2.2 母液的配制

称量26.2 mg HPTS固体，用超纯水溶解并定容至10 mL，低温避光保存，待用（母液浓度为5 mmol/L）。采用相同方法配制100 mmol/L的待测物母液。

2.3 线性响应及检出限的确定

将996 μL 10 mmol/L PB缓冲液（pH=7）加入到样品池中，加入1 μL HPTS母液，混合均匀后，测定荧光光谱； 随后，向样品池中逐渐添加适量PNA，充分混合均匀后（30 s），测定对应光谱； 当混合物的光谱响应强度基本保持不变时停止测试。根据IUPAC计算得到检出限。 荧光光谱的激发波长为403 nm，激发光和发射光的狭缝宽度为3.0 nm。

2.4 选择性及干扰效应测试

在含有10 mmol/L PB缓冲液的样品池中，加入1 μL HPTS母液和3 μL不同的干扰物母液，充分混合均匀，测定选择性的荧光光谱； 类似的，向含有10 mmol/L PB缓冲液的样品池中，加入1 μL HPTS、3 μL PNA和3 μL 干扰物，充分混合均匀后，测定干扰性的荧光光谱。

2.5 水样处理、分析

自来水和土壤（北京）经过离心和过滤处理，加入到样品池中，再加入1 μL HPTS母液，混合均匀后，测定荧光光谱； 随后，向样品池中逐渐添加适量PNA，测定对应光谱； 当混合物的光谱响应强度基本保持不变时停止测试。

3 结果与讨论

3.1 实验条件选择

HPTS荧光探针检测PNA的机理如图1所示。在以HPTS为探针荧光检测PNA中，考虑到二者相互作用的动力学问题，首先考察了HPTS与PNA在随后的1、3、5、7和10 min内基本维持不变。此结果表明HPTS与PNA作用迅速，可在短时间内达到平衡。在混合后的1～10 min内进行测量，可以忽略混合时间所产生的影响。为了实现最佳传感性能，考察了溶液pH值对荧光响应的影响（图3）。在不同pH条件下， PNA对HPTS的荧光淬灭程度有轻微波动，在H=70达到最大（86.4%）。因此后续实验选择H=70。endprint

3.2 传感性能研究

在上述条件下，研究了HPTS的发射光谱随PNA浓度变化情况。由图4可见，在为403 nm入射光激發下，HPTS的最大发射波长位于512 nm，此结果与文献[17]相符。随着PNA加入浓度逐渐增大，512 nm的发射强度逐渐衰减，当[PNA]=500 μmol/L时，发射峰强仅余初始的2.8%。这验证了HPTS作为探针快速检测PNA的可行性。值得注意的是，在PNA浓度逐渐增加过程中，512 nm荧光强度（I）与初始值（I0）的比值（I/I0）与PNA浓度在一定范围内（10 ～ 120 μmol/L）呈良好的线性关系，其相关系数r=0.999。这表明本方法可用于PNA的定量检测。根据IUPAC规定的传感器灵敏度计算方法可得，此探针对PNA的检出限（LOD）为4.8 μmol/L。由于HPTS的荧光发射位于可见光区，PNA导致的荧光淬灭也可通过肉眼进行观测。图5给出了不同浓度PNA存在下HPTS的荧光照片。在未加入PNA时，HPTS溶液可以观测到明亮的绿色荧光； 当加入50 μmol/L PNA时，HPTS的荧光发生了明显下降； 随着不同浓度PNA的加入，HPTS绿色荧光逐渐变暗直至消失。因此，该探针可用于PNA的可视化检测，检出限为50 μmol/L。

3.3 选择性研究

从图6可见，除PNA外，所有其它物质的I0/I≈107，而PNA的I0/I=780，是其它化合物的7倍以上， 此结果表明HPTS探针对PNA具有优异的选择性。 溶液荧光颜色的变化也可用于PNA的定性识别。如图6B所示，只有PNA能够使HPTS发生淬灭而变暗，其它物质均不会影响其亮绿色荧光的产生。此结果再次证实了HPTS对PNA的特异性。在上述结果的基础上，对传感机制开展了研究。首先，对比了PNA、苯胺和硝基苯的化学结构后可知，PNA对HPTS荧光的淬灭是硝基与氨基协同作用的结果，氢键可能是主要作用力之一。为此对比了HPTS与HPTS/PNA的吸收光谱，发现加入PNA后，HPTS在455 nm的吸收峰下降，而在368 nm处的吸收峰升高，同时蓝移5～6 nm，这表明了HPTS的8位羟基质子化状态的改变[23]，一定程度上证实了氢键存在的可能。其次，荧光寿命测量显示，HPTS的平均寿命为13.1 ns，分别加入10、30和50 μmol/L PNA后，寿命分别为12.9、12.6和12.3 ns，相对于初始值未发生显著变化，说明PNA对HPTS荧光的淬灭并非动态机制，而是由于二者静态复合物的形成[18]； 此外，核磁共振氢谱的实验结果表明，HPTS与PNA混合后，芳环区质子的化学位移均向高场区移动了δ 0.2～0.3，表明二者之间存在着nn作用[16]。综上所述，PNA的硝基、氨基与HPTS通过氢键、nn等相互作用形成复合物， 导致了HPTS荧光淬灭。

3.4 应用研究

为了验证方法的实用性，首先对方法的抗干扰能力进行了研究。将干扰物与PNA混合，考察HPTS对混合样品的荧光响应情况。在实验中，对比了Na+、K+、Ca2+、Mg2+、C

4、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、苯胺、对甲氧基苯胺、对氨基氟苯、对氨基苯甲酸、对氨基苯酚及硝基苯对PNA传感的干扰情况。由图7可见，与空白比较，干扰物存在时HPTS对PNA的荧光响应几乎未受影响，表明本方法对PNA检测具有较好的抗干扰能力。

基于上述结果，将HPTS直接用于实际样品中PNA的测试。采集自来水（北京）进行分析研究，并采用样品加标法测定。如图8所示，HPTS在自来水中对PNA的传感性能与缓冲液中性能基本一致，线性范围为10～120 μmol/L，相关系数r=0.997，检出限为4.6 μmol/L。将本方法应用于土壤样品中PNA残留的测试，得到了与自来水相似的结果，在土壤样品提取液中PNA检测的线性范围为10～120 μmol/L，相关系数r=0.999， 检出限为8.1 μmol/L。上述结果表明此传感器适用于实际水样中PNA的检测，具有较好的潜在应用价值。

4 结 论

利用阴离子型芘基探针HPTS建立了一种PNA的快速可视化荧光检测法。与常规方法相比，本方法具有快速、简单、环保、特异性高、抗干扰能力强等特点。检测机制基于二者之间非共价相互作用而形成的超分子复合物。本方法的线性范围为10～120 μmol/L，可用于实际水样中PNA的检测。endprint