马兜铃酸的毒性研究及思考

高月　肖小河　朱晓新　梁爱华　张伯礼

[摘要]2017年10月18日，Science Translational Medicine發布题为“Aristolochic acids and their derivatives are widely implicated in liver cancers in Taiwan and throughout Asia”的研究论文，该文指出含马兜铃酸的草药可通过诱导特异性的“马兜铃酸突变指纹”诱发肝癌，并建议公众避免摄入含有马兜铃酸的草药。我国自2000年始，针对含马兜铃酸的中草药，国家食品药品监督管理总局（CFDA）陆续取消了关木通、广防己和青木香等的药用标准，并通知加强相关药物监管；《中国药典》中也逐渐取消一系列相关中草药的记载。此文发表后，国家中医药管理局快速启动了关于马兜铃酸的“毒性”问题研讨会，与会专家对国内外关于马兜铃酸的毒性研究进行了充分讨论，发现暴露史、致癌剂量和潜伏期不明确，乙肝等关键影响因素未纳入分析，样本量小、混杂因素多，证据链不完整，数据间巨大差异缺少解析，基础研究论据不足等是目前研究存在的主要问题。为了正确认识马兜铃酸的毒性和致癌风险、指导临床安全合理用药，专家们提出如下建议：①尽快完善马兜铃酸致癌性的系统评价，科学阐明马兜铃酸与肝癌发生的关系；②制定含马兜铃酸类药物安全用药风险警示，进一步加大监管力度；③深化中药毒性的临床研究，逐步明确所有中药的临床不良反应。

[关键词]马兜铃酸； 毒性； 基因突变； 肝癌

[Abstract]On October 18th， 2017， a research article named "Aristolochic acids and their derivatives are widely implicated in liver cancers in Taiwan and throughout Asia" was published on Science Translational Medicine This article pointed out that herbs containing aristolochic acids could cause liver cancer by inducing the specific "aristolochic acids mutational signature" The public was also suggested to avoid the intake of herbs containing aristolochic acids Since 2000， CFDA has gradually abolished the medicinal standards for herbs containing aristolochic acids such as caulis aristolochiae manshuriensis， aristolochia heterophylla and radix aristolochiae Related drugs have been strengthened supervision since then Chinese Pharmacopoeia has also removed the records of a series of related herbs State Administration of Traditional Chinese Medicine held a conference on the "toxicity" of aristolochic acids as soon as the article was published After a discussion of the studies on the toxicity of aristolochic acids， experts attending the meeting discovered several problems， including the unclearness of exposure history， tumorproducing dose and latent period， the absence of some key factors such as hepatitis B， the small sample size， miscellaneous factors， incomplete evidence chains， the missing of analyses between data with huge differences， the insufficiency of fundamental research arguments， etc In order to understand the toxicity of aristolochic acids and the carcinogenic risks， as well as guide clinical safe medication， the experts suggested that：①Complete the systematical evaluation of aristolochic acids carcinogenicity as soon as possible Scientifically elucidate the relationship between aristolochic acids and the genesis of liver cancer ②Establish medication risk warnings of aristolochic acids and strengthen the supervision ③Make an indepth study of the toxicity of traditional Chinese medicine Find out the adverse effects of all traditional Chinese medicine step by step.endprint

[Key words]aristolochic acid； toxicity； gene mutation； liver cancer

2017年10月18日，来自新加坡和台湾的研究人员在Science子刊Science Translational Medicine发布题为“Aristolochic acids and their derivatives are widely implicated in liver cancers in Taiwan and throughout Asia”的研究论文[1]。该文章以封面故事的形式指出中草药的黑暗面（毒副作用）。其主角——马兜铃酸（aristolochic acids，AA），是一类广泛存在于马兜铃科植物和多种天然草药中的物质。已有研究发现马兜铃酸经体内代谢可形成马兜铃酸内酰胺氮离子，马兜铃内酰胺氮离子具有很强的亲电能力，能与DNA碱基环外氨基亲电结合，生成相应的加合产物，即脱氧腺苷加合物（dAAAI）和脱氧鸟苷加合物（dGAAI），进而诱导基因产生一种突变——AT颠换突变[2]。这篇文章的研究者指出AT颠换这一特异性的突变可以作为马兜铃酸致突变的基因指纹，通过外显子测序能够快速发现这一突变指纹。基于这一发现，他们对台湾的98例（长庚纪念医院21例、国立台湾大学77例）肝癌患者的肝癌组织和血液样本进行全外显子测序，在其中76个（78%）患者样本中发现马兜铃酸突变指纹，并由此推测：马兜铃酸可能是诱发肝癌的重要因素。所以，他们提示含马兜铃酸的草药具有非常强的致突变作用，除了能够诱发肾毒性外，还可能是导致肝癌的重要原因。因此，建议公众采取一级预防措施，避免摄入含有马兜铃酸的草药，并探讨二级预防措施，即以“马兜铃酸突变指纹”对马兜铃酸可能导致的肝癌进行“三早”（即早发现、早诊断、早治疗）预防。该文一经发表，马兜铃酸再次迅速成为舆论“焦点”，引起国内外各界的广泛关注和讨论。

1国内对含马兜铃酸中草药的管理

我国国家食品药品监督管理总局（CFDA）和医药界也非常关注马兜铃酸的毒性作用。规范管理含有马兜铃酸类化合物中草药的工作在我国早已展开，并一直持续进行着。早在1964年吴寒松已对过量服用马兜铃科关木通导致急性肾功能衰竭的病例进行报道[3]。20世纪90年代，“比利时减肥药（广防己）”、“龙胆泻肝丸”等事件的发生，以及含马兜铃酸中成药引发肾功能损害的病例数量也不断增多，促使含马兜铃酸中草药的毒性研究进一步深入、管理更加严格。2000年版《中国药典》关木通品种下进行了使用限定，在注意项下注明“不可多用、久服；肾功能不全及孕妇忌服。”2001年，多个部门和专家2次专题讨论关木通安全性问题。国家中医药管理局也将此列为重点课题予以立項资助进行研究，国家自然科学基金委也陆续投入了434万元资金用于资助19个与马兜铃酸相关的科研项目。此后，随着马兜铃酸DNA加合物及其肾脏毒性和致癌作用的发现，我国对含马兜铃酸的中草药也提出了更严谨的监督管理规范：CFDA于2003年取消了关木通的药用标准、2004年又取消了广防己和青木香的药用标准，并提出加强含马兜铃、寻骨风、天仙藤和朱砂莲的中药制剂的监督管理；2005年版《中国药典》亦开始逐步取消记录中含有马兜铃酸的中草药，至2015年版《中国药典》仅天仙藤、马兜铃和细辛3种含有马兜铃酸的药物仍记录在其中。此文发表后1周内，国家中医药管理局快速组织中医药界专家讨论马兜铃酸的“毒性”问题，研讨解决方案，以保证人民群众用药安全。其实，基于当时的回顾性研究和前瞻性研究结论，张伯礼院士已在2004年10月《药物警戒》发表文章指出：针对马兜铃酸的毒性作用和含马兜铃酸中草药面对的问题，“应实事求是、冷静处置，既不否认，也不盲从，宜采取先限制、再研究的措施，加强宣传、教育，对医生、患者、中药企业及新药研制者，强化行政干预措施。”[4]

2含马兜铃酸中草药毒性作用的前期研究

国内对含马兜铃酸的中草药进行了一系列的毒理学评价和比较系统的致癌作用研究。中国中医科学院梁爱华研究员课题组对含马兜铃酸中草药的毒性、致突变性和致肿瘤作用进行了大量、深入的研究[56]；杜贵友研究员课题组对马兜铃酸在大鼠体内的毒代动力学和组织分布进行了系统的研究[7]。浙江大学楼宜嘉教授课题组对马兜铃酸Ⅰ致胚胎干细胞衍生肝样组织癌前病变进行了比较科学的研究[8]。

21马兜铃科关木通及木通科三叶木通、五叶木通对小鼠的急性毒性研究关木通为马兜铃科植物东北马兜铃Aristolochia manshuriensis Kom的干燥藤茎，提取物单次给药后，未出现动物死亡的剂量为生药浓度262 g·kg-1（折合成马兜铃酸约为26 mg·kg-1），相当于人用剂量的262倍（按体表面积折算29倍），导致半数动物死亡的剂量为生药浓度537 g·kg-1（折合成马兜铃酸约为53 mg·kg-1），相当于人用剂量的537倍（按体表面积折算59倍）。给小鼠单次灌胃关木通提取物或精制的关木通马兜铃总酸，二者所致的毒性特征一致、死亡时程相似，以马兜铃酸计，两者对小鼠的LD50相近，说明关木通提取物单次给药的致死作用与对应剂量的马兜铃总酸的致死作用相近，且动物死亡率与马兜铃酸呈明显的剂量反应关系，这表明马兜铃酸是引起关木通急性毒性主要毒性物质。

由于关木通的药用标准已经被取消，并以木通科三叶木通、五叶木通代替，故对这2种木通的急性毒性进行了观察。按照可配制的最大浓度及最大体积给小鼠灌胃，一日给药2次，三叶木通和五叶木通均未引起动物异常表现和死亡。2种木通对小鼠的最大耐受量倍数已远高出人口服用量的2 000倍，所以认为三叶木通和五叶木通的毒性远较关木通低，可以考虑在药效不降低的情况下使用这2种木通科木通代替关木通。

22关木通及关木通马兜铃总酸的急性肾毒性研究给小鼠单次灌胃不同剂量的关木通，同时以精制的关木通马兜铃总酸作对照，观察对小鼠的肾损害作用。结果显示，给予关木通和马兜铃酸后，动物的血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平呈剂量依赖性增高；除关木通最小剂量组外，血清谷草转氨酶在其他剂量组及马兜铃酸组均出现显著增高，并呈剂量依赖性。组织形态学上显示肾脏出现明显病变，并且肾脏损害随剂量加大逐渐加重；肝脏只在高剂量组存在病理改变。endprint

23关木通及关木通马兜铃酸的慢性肾损害研究采用2000年版《中国药典》中推荐的人日用药剂量等倍（按体表面积折算后与《中国药典》中推荐的人日用药剂量相等）、5倍、10倍、20倍的关木通提取物，同时用与关木通20倍剂量组马兜铃总酸含量相当的精制关木通马兜铃总酸作为对照，给大鼠灌胃，隔周给药7 d，给药试验期为26周，并停药观察4周。结果显示，随着给药时间的延长，关木通20倍剂量组在给药过程中出现明显的全身毒性。关木通5倍及以上剂量组长期用药后可引起明显贫血症状。肾脏是关木通最主要的毒性作用靶器官。肾损害的临床表现包括多尿、低比重尿、血尿、蛋白尿、糖尿以及尿β2微球蛋白和N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶排出增高，此外还伴有血液BUN升高，血液肌酐水平变化不明显。组织形态学显示，肾脏的病变部位多位于皮质或皮髓交界处，肾脏病变发展过程为肾小管细胞变性（严重者可坏死）→炎性细胞浸润和纤维细胞增生→肾间质进行性纤维化，及肿瘤形成。

从引起肾毒性的剂量和累积用药时间来看，关木通仅为临床等倍剂量（生药浓度06 g·kg-1，折合成马兜铃总酸量为07 mg·kg-1），累积用药3周，即引起明显肾损害，出现肾毒性的最低马兜铃酸累积用量约为16 mg·kg-1；低剂量组造成肾损害的马兜铃酸累积阈剂量明显低于高剂量组（等倍剂量组马兜铃总酸用量累积约为16 mg·kg-1，20倍剂量组累积约为315 mg·kg-1时出现肾损害）。

采用精制马兜铃总酸给大鼠长期灌胃后，在给药过程中以及停药期间所表现出的毒性反应、毒性反应发生时间及程度均与含有相当剂量马兜铃总酸的关木通提取物（关木通20倍剂量组）组相似，表明关木通蓄积毒性的物质基础主要是马兜铃总酸。

24关木通和关木通马兜铃总酸的致突变性研究在小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验中，关木通提取物的剂量为LD50（小鼠）的1/4，1/2和LD50 3个剂量（折合成马兜铃酸分别为13，27，53 mg·kg-1），同时以与关木通提取物LD50相当的马兜铃总酸作为对照，观察给药后24 h小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率。结果显示，关木通提取物的1/4 LD50，LD50组及关木通马兜铃总酸组，引起嗜多染红细胞微核发生率轻度但有统计学意义的增加，马兜铃总酸组的微核发生率明显高于关木通提取物各组。这提示关木通和关木通马兜铃总酸具有一定的致突变性。

25关木通和关木通马兜铃总酸的致肿瘤作用研究通过在关木通的长期毒性观察动物的肿瘤发生情况，结果显示，关木通所有剂量组均出现了多脏器肿瘤生长，主要发生部位有肾脏、皮下、胃和膀胱。除了关木通人日用药剂量等倍组以外，5倍、10倍、20倍的关木通剂量组均发生了肾脏肿瘤，皮下、胃和膀胱的肿瘤也均有出现。膀胱和前胃肿瘤发生最早，在用药后较短时间内很快发生（试验第6周，累积用药3周），皮下肿瘤和肾脏肿瘤的出现时间稍晚，但仍早于试验第12周。肿瘤发生具有明显的剂量关系和时间关系，而且小剂量组较大剂量组出现肿瘤的累积阈剂量明显降低，发生肿瘤的马兜铃总酸最低累积用药量仅为16 mg·kg-1。有些脏器肿瘤的发生存在性别差异，

雌性动物的皮下肿瘤明显多于雄性，胃部肿瘤在雄性动物多于雌性动物，膀胱和肾脏肿瘤发生的性别差异不明显。马兜铃总酸组的肿瘤生长类型、出瘤时间以及肿瘤生长速度与含相当剂量马兜铃总酸的关木通提取物剂量组（20倍剂量组）一致，表明关木通的致肿瘤作用与马兜铃总酸密切相关。

26马兜铃酸Ⅰ在大鼠体内的毒代动力学及组织分布研究毒性剂量下的马兜铃酸I的代谢符合血管外给药二室开放模型。大、中剂量组的主要代谢参数如下：分布相半衰期分别为103，045 h；消除相半衰期分别为610，654 h；清除率分别为302，141 mL·min-1·kg-1；药时曲线下面积（AUC）分别为3310，3522 mg·L-1·h-1；达峰时间分别为062，135 h。马兜铃酸I及马兜铃内酰胺I的组织分布范围较广，且蓄积程度较高。与空白对照组比较，中、高剂量组大鼠给药后血清肌酐、血尿素氮明显升高（P<001）。组织病理学检查结果显示，大剂量组大鼠肾小球包氏囊内新月体形成，肾小管坏死、消失。大鼠肾损害的程度与肾脏中马兜铃内酰胺Ⅰ浓度相关。

27马兜铃酸I致胚胎干细胞衍生肝样组织癌前病变研究5 μmol·L-1以上的马兜铃酸Ⅰ可诱导肝样组织中出现少量原癌蛋白Myc，癌胚RNA结合蛋白Lin28同源物B，甲胎蛋白等共表达的肝样细胞，同时NFκB（p65）也有少量入核激活，這提示马兜铃酸Ⅰ可诱导胚胎干细胞衍生拟胚体分化肝样组织炎性损伤伴癌前病变型特征，引发癌前病变，但是马兜铃酸及其衍生物是否可以直接诱导肝癌的发生还有待进一步研究。

3针对该文尚需进一步讨论的问题

31暴露史、致癌剂量和潜伏期不明确论文仅发现亚洲部分国家或地区肝癌患者含有马兜铃酸相关特征突变谱比例较高，但是并无直接证据证实含有特征突变谱的患者服用过含马兜铃酸相关制剂，对服用马兜铃酸相关制剂药物种类、含量以及服用剂量、时间和疗程等情况没有调研，也没有对样品中马兜铃酸及其衍生物进行检测，缺乏药物流行病学证据。有待对文章涉及的病例进行回顾性分析，确定他们的马兜铃酸暴露史，并寻找可能的马兜铃酸致癌剂量和潜伏期。

32乙肝等关键影响因素未纳入分析我国是原发性肝癌的高发国。2017年9月28日在中国临床肿瘤学会（CSCO）年会肝癌专场上备受瞩目的《中国原发性肝癌临床登记调查》首次对外发布，在此次5 114例原发性肝癌病例纵向研究中，基础肝病比例很高，仅有乙型病毒性肝炎（乙肝）2 599例（占5082%），仅有丙型病毒性肝炎145例（283%），乙型肝炎合并丙型肝炎感染13例（025%）；病毒性肝硬化1 590例（占3109%）；不确定肝硬化类型的135例（占263%）；其他肝病（酒精性肝病、脂肪肝）5例（占009%）[9]。由此可见，乙肝是原发性肝癌主要的发病因素。如果马兜铃酸是导致肝癌的诱因，那么按照文中的突变比例，中国大陆和台湾地区主要致肝癌的因素已然成为马兜铃酸，这显然与实际不相符合。因此，对于乙肝等其他因素诱导的肝癌与马兜铃酸诱导突变之间的关系尚需进一步研究。endprint

33样本量小、混杂因素多该研究的关键病例数较少，样本代表性不足，难以反映不同国家和地区肝癌发生的客观真实性。尽管文章纳入世界范围内的1 400多例肝癌患者进行研究，但是高突变国家和地区的病例数较少，中国台湾地区病例仅来源于曾遭受辐射污染（60Co钢筋）地区的长庚纪念医院（桃园市）和台北大学医学院（台北市）[1011]，这些突变和肿瘤与患者居住、生活、工作环境是否有关需引起关注；文章其他89例中国病例已知88例来源于中国香港，缺乏中国大陆病例数据，难以反映中国大陆肝癌发生的客观真实性。

34证据链不完整马兜铃酸与肝癌发生的安全性风险信号尚缺少完整的证据链，该研究仅做了肝癌临床样本分析，缺乏正常人或其他类型肝病患者临床样本的分析，同时服用和未服用马兜铃酸相关制剂人群含有其特征突变谱的比例数据缺乏。因此，马兜铃酸及其衍生物与相关基因突变、肝癌之间的因果关系有待进一步证实。

35数据间差异缺少解析文中指出研究者们检查了肝癌患者的马兜铃酸突变指纹与多种临床和流行病学变量之间的关系（如医院，肝硬化状态，乙型肝炎携带者状态，丙型肝炎携带者状态，肝炎病毒携带者的状态，2003年台湾禁止使用含有AA的植物前或后被诊断为肝癌，性别，确诊日期和确诊年龄）。由于祖国大陆与台湾人民同宗同源，同样信任传统医学的疗效，因此对中草药的应用范围亦很广泛，含有马兜铃酸的中成药在国内依然在医院的严格规范下继续使用。然而，该文的流行病学统计数据却显示出：台湾的98例肝癌病理样本，78%具有马兜铃酸诱变的特征，大陆的89例肝癌标本中，有47%符合马兜铃酸基因突变特征[1]。其中，巨大差异的产生原因需要进一步说明。

36基础研究论据不足在基础研究方面，该课题组2013年发表的文章指出：①马兜铃酸连续作用6个月的HK2细胞中可以检测到马兜铃酸突变指纹（AT颠换突变），但诱导剂量未给出；②连续3 d给予C57BL/6小鼠50 mg·kg-1的马兜铃酸，于30，60，90 d处死后，对其诱导肾病进行观察，可见肾毒性病变。该剂量接近于马兜铃酸的单次口服的半数致死剂量，若以关木通的马兜铃酸含量进行折算，相当于关木通人用剂量的500多倍，远超于规范服用剂量。而且，结合2017年10月18日新发表的论文，2篇均未见动物组织中马兜铃酸突变指纹（AT颠换突变）的检测结果，亦未能看到其在动物肾脏外其他组织，尤其在肝脏的致癌和致突变情况。因此，常规条件下按规范服用含马兜铃酸中药即可诱导肝癌发病的结论是分析推测性的，尚需要更多的基础研究论据。

4建议与应对措施

尽管马兜铃酸与肝癌发生的相关性缺乏直接证据，但至少提示了中药成分马兜铃酸可致肝癌发生的强烈风险信号。针对中药成分马兜铃酸可能导致肝癌发生的强烈风险信号，临床和科研人员应对此进行进一步研究，开展相关药物流行病学调查，筛查中药成分马兜铃酸衍生物及其特征突变谱在中国大陆肝癌中的比例，系统评价其致癌性，科学阐明马兜铃酸与肝癌发生是否具有直接或因果关系，尽快地给社会一个明确的结论。

根据该论文所提示的强烈风险信号，结合国内外马兜铃酸相关研究进展以及专家意见，尽快制定并出台含马兜铃酸类药物安全用药风险警示，尤其是针对马兜铃酸含量较高、用药时间较长的中成药，进一步加大监管力度，严格管控用药的适应证、剂量与疗程，最大限度地保障人们用药安全和身体健康。

我们应该把中药安全性问题研究作为中医药事业发展的重大科技问题列入长期优先支持领域，特别是要注重结合临床开展深入系统研究，力争利用10～20年时间实现中药临床不良反应从“尚不明确”到基本明确。

[参考文献]

[1]Alvin W T Ng， Song Ling Poon， Mi Ni Huang， et al. Aristolochic acids and their derivatives are widely implicated in liver cancers in Taiwan and throughout Asia[J]. Sci Transl Med， 2017， 9：eaan6446.

[2]Marie Stiborová， Volker M Arlt， Heinz H Schmeiser DNA adducts formed by aristolochic acid are unique biomarkers of exposure and explain the initiation phase of upper urothelial cancer[J]. Int J Mol Sci， 2017， 18：2144.

[3]吴松寒 木通所致急性肾功能衰竭二例报告[J]. 江苏中医药， 1964（10）：12.

[4]张伯礼， 马红梅 关木通肾脏毒性研究及对策[J]. 药物警戒， 2004， 1（2）：24.

[5]丁晓霜，梁爱华，王金华，等 关木通及其马兜铃总酸对小鼠肾脏毒性的研究[J]. 中国中药杂志， 2005， 30（13） ：1019.

[6]李春英， 梁爱华， 高双荣， 等 大鼠胃癌前病变模型的建立[J]. 中国中药杂志， 2012， 37（1）：89.

[7]刘莎， 杜贵友， 李丽， 等 马兜铃酸Ⅰ在大鼠体内的毒代动力学及组织分布研究[J]. 药物不良反应杂志， 2006， 8（3）：169.

[8]李彤 马兜铃酸Ⅰ致胚胎干细胞衍生肝样组织癌前病变评价模型建立[D]. 杭州：浙江大学， 2017.

[9]秦叔逵， 董家鸿， 卢实春， 等 中国原发性肝癌临床登记调查初步报告[C]. 厦门：第20届全国临床肿瘤学大会暨2017年CSCO学术年会，2017.

[10]Chen W L， Luan Y C， Shieh M C， et al. Effects of cobalt60 exposure on health of Taiwan residents suggest new approach needed in radiation protection[J]. DoseResponse， 2007， 5（1）：63.

[11]Chang W P， Chan C C， Wang J D 60Co contamination in recycled steel resulting in elevated civilian radiation doses：causes and challenges[J]. Health Physics， 1997， 73（3）：465.

[12]Poon S L， Pang S T， Mcpherson J R， et al. Genomewide mutational signatures of aristolochic acid and its application as a screening tool[J]. Sci Transl Med， 2013， 5（197）：197ra101.

[13]Moriya M Slade， Brdar B， Medverec Z， et al. TP53 Mutational signature for aristolochic acid：an environmental carcinogen[J]. Int J Cancer， 2011， 129（6）：1532

[責任编辑马超一]endprint