响应面法优化牛骨肉蛋白液酶解工艺条件

樊晓盼，仇泓博，马俪珍



响应面法优化牛骨肉蛋白液酶解工艺条件

樊晓盼，仇泓博，马俪珍通信作者

（天津农学院食品科学与生物工程学院天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）

以高压浸提后的牛骨肉蛋白液（蛋白含量2.15%）为研究对象，通过单因素和响应面法优化试验，分别研究风味蛋白酶和复合蛋白酶的酶解条件对酶解液水解度和氨基态氮含量的影响，进而优选出两种酶单独添加时的最佳酶解工艺条件。结果表明：风味蛋白酶的最佳酶解条件为酶解温度45℃、酶解时间4.3 h、酶添加量50 LAPU/g蛋白质，在此条件下水解度为15.88%；复合蛋白酶的最佳酶解条件为酶解温度45℃、酶解时间4.5 h、酶添加量15 000 U/g，在此条件下水解度达到12.78%。

牛骨肉；酶解工艺；风味蛋白酶；复合蛋白酶；水解度

我国是畜牧业大国，猪、牛、羊等畜禽肉平均年产量可达8 454×104t，以畜禽骨占胴体10%估算，我国每年可产生845×104t[1-4]。骨中含有丰富的营养物质，包括蛋白质、脂肪、氨基酸、骨胶原、粘多糖、软骨素以及矿物质等多种人体所需的营养素，是一种营养全面的天然资源[5-7]。但由于人们消费观念的影响以及我国加工技术水平的制约，大部分畜禽骨未能被充分加工利用或仅加工成附加值很低的产品[8-10]。

骨中蛋白质含量丰富，且骨蛋白生物学效价高，属于一种优质蛋白，然而我国蛋白质资源十分紧张，因此充分开发利用骨副产物中的蛋白质对缓解我国蛋白资源紧张具有重要意义[11-12]。目前，国内外学者对骨蛋白的研究主要集中于通过酶解技术，将骨蛋白降解为小分子物质进行利用。余杰[13]等利用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，对鳗鱼头酶解条件进行优化，再经脱苦脱色处理后研制出一种高级海鲜风味调料。朱瀛等[14]等采用中性蛋白酶对鸡骨泥进行酶解，通过优化酶解条件最终制得一种具有抗氧化性的鸡骨短肽。Suroukat等[15]采用胃蛋白酶对鸡头骨蛋白进行酶解，确定了最佳酶解条件，并检测到酶解液中含有丰富的氨基酸，为肉味香料的制备提供前体物质。

目前我国每年要从国外进口大量的冷冻畜禽胴体，在用电锯进行分割过程中，会产生大量的牛骨肉锯末（简称牛骨肉），经检测，这种牛骨肉中含有丰富的蛋白质（16.51%）、脂肪（8.71%）等营养物质[16]。在前期优化高压浸提牛骨肉蛋白条件的基础上，本研究以高压浸提的牛骨肉蛋白液为底物，以水解度和氨基态氮含量为评价指标，通过单因素和响应面优化试验，研究风味蛋白酶和复合蛋白酶单独添加时的最佳酶解条件，为美拉德反应制备肉味香料提供最佳酶解方式和充分的前体物质，进而为工业化精深加工牛骨肉提供理论和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛骨肉，由顶兴（天津）食品科技发展有限公司提供；风味蛋白酶（活力：500 LAPU/g）、复合蛋白酶（活力：150 000 U/g），购于丹麦诺维信酶制剂有限公司。

试剂：氢氧化钠、酚酞、甲醛，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004精密分析天平（上海精科仪器公司）；移液枪（Eppendovf公司）；SX-500高压蒸汽灭菌锅（日本TOMY有限公司）；THZ-98AB型恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 牛骨肉蛋白浸提液的制备

根据前期试验结果，称取25 g牛骨肉（水分含量49.66%），按照料水比为1∶4的比例添加自来水，在压力0.2 MPa、浸提温度133 ℃条件下浸提4 h得到牛骨肉蛋白浸提液（蛋白含量为3.0 g/100g）。

1.3.2 单因素试验

以上述牛骨肉蛋白浸提液为酶解底物，调节pH为7，添加风味蛋白酶或复合蛋白酶，分别以酶解温度、酶解时间和酶添加量为自变量，以水解度和氨基态氮含量为因变量，通过单因素试验（表1）研究酶解条件对牛骨肉蛋白浸提液的酶解效果。

表1 单因素试验水平

1.3.3 响应面优化试验

在单因素试验结果的基础上，以蛋白水解度为响应值，采用Design Expert软件设计3因素3水平试验，分别对两种酶（风味蛋白酶和复合蛋白酶）的酶解时间、酶解温度以及酶添加量进行优化。因素水平及编码见表2和表3。

表2 风味蛋白酶响应面试验因素及水平编码值

表3 复合蛋白酶响应面试验因素及水平编码值

1.4 指标测定

氨基态氮含量的测定[17]：甲醛电位滴定法。

1.5 数据处理

用Microsoft Excel 2003对试验数据进行预处理，Statistix 8.1进行数据分析，显著性差异（＜0.05）通过Turkey test程序进行，Sigmaplot 10.0作图。响应面试验采用Design-Expert 7.0设计并进行结果分析，通过建立回归方程、绘制等高线和三维曲面图，对任意两种因素的交互效应进行分析评价。

2 结果与分析

2.1 酶解温度对牛骨肉蛋白酶解液水解度和氨基态氮含量变化的影响

图1（A）和图1（B）分别代表随着温度的变化风味蛋白酶和复合蛋白酶对牛骨肉蛋白酶解液的水解度和氨基态氮含量的影响。由图1可以看出，在30～70 ℃范围内，随着温度的升高，两种酶作用的酶解液水解度和氨基态氮含量均呈先上升后下降的趋势。这是因为在30～50 ℃范围内，温度越高，酶与底物的作用机会越多，氨基态氮含量越高，水解度就越大；但是当温度超过50 ℃后，则会导致酶活性逐渐失活，从而导致水解度降低[18]。如风味蛋白酶在50 ℃时，水解度和氨基态氮含量达到最高，水解度为15.89%，氨基态氮含量为71.23 mg/100g；复合蛋白酶分别在50 ℃和60 ℃时，两者水解度和氨基态氮含量差异不显著（＞0.05），但考虑到加工的可操作性和成本问题，所以选择两种蛋白酶的适宜酶解温度均为50 ℃。

A风味蛋白酶 B复合蛋白酶

2.2 酶解时间对牛骨肉蛋白酶解液水解度和氨基态氮含量变化的影响

图2（A）和图2（B）分别代表随着酶解时间的变化风味蛋白酶和复合蛋白酶对酶解液水解度和氨基态氮含量的影响。由图2可以看出，在1～5 h范围内，随着酶解时间的延长，两种蛋白酶整体上使牛骨肉蛋白酶解液的水解度和氨基态氮呈缓慢上升趋势。

图2（A）显示，当风味蛋白酶的酶解时间为3 h时，水解度和氨基态氮含量分别为15.93%和71.40 mg/100g；当酶解时间增加为4 h时，水解度和氨基态氮含量并未出现明显变化（＞0.05）；但若继续延长至5 h，水解度和氨基态氮含量则会明显提高，水解度达到17.84%，氨基态氮含量达到79.98 mg/100g，差异达显著水平（＜0.05），然而由于过度水解会导致苦味肽的产生[19]，结合感官评定，并考虑实际生产中的各工序时间安排和成本问题，故选择风味蛋白酶适宜酶解时间为3 h。

A风味蛋白酶 B复合蛋白酶

从图2（B）可看出，当复合蛋白酶的酶解时间为3 h时，水解度和氨基态氮含量分别为15.66%和70.18 mg/100g，但当延长酶解时间至5 h时，酶解液的水解度和氨基态氮含量均无显著变化（＞0.05），所以，选择复合蛋白酶的适宜酶解时间为3 h。

2.3 添加量对牛骨肉蛋白酶解液水解度和氨基态氮含量的影响

图3（A）和图3（B）分别代表风味蛋白酶和复合蛋白酶的添加量对牛骨肉蛋白酶解液水解度和氨基态氮含量的影响。由图3可以看出，随着两种蛋白酶添加量的增加，酶解液的水解度和氨基态氮含量整体呈上升趋势（＜0.05），但变化速率不同。从图3（A）可以看出，当风味蛋白酶添加量在10～30 LAPU/g范围内，水解度随着加酶量增加而迅速增加；但酶添加量为30～50 LAPU/g范围内增幅明显减缓（＞0.05）；从图3（B）可看出，当复合蛋白酶添加量从3 000 U/g增加到9 000 U/g时，水解度和氨基态氮含量明显增加（＜0.05），相应的数值增加到15.81%和70.88 mg/100 g；但当酶添加量继续增加到15 000 U/g时，水解度和氨基态氮含量变化并不明显（＞0.05）。所以，综合考虑酶解效果和加工成本，确定风味蛋白酶的添加量为30 LAPU/g，复合蛋白酶的添加量为9 000 U/g。

A风味蛋白酶 B复合蛋白酶

2.4 响应面试验确定最佳浸提工艺参数

在单因素试验结果的基础上，使用Design- Expert 7.0软件，依据Box-Behnken中心组合试验设计原理设计响应面优化分析试验，研究酶解温度（A）、酶解时间（B）和酶添加量（C）3个因素对牛骨肉蛋白酶解液水解度（Y）的影响。

2.4.1 风味蛋白酶酶解牛骨肉蛋白浸提液的响应面优化

风味蛋白酶酶解温度（A）、酶解时间（B）和酶添加量（C）3个因素响应面中心组合试验设计及结果见表4。

表4 响应面中心组合试验设计及结果

利用Design-Expert 7.0软件对上述试验结果进行多元线性回归分析，建立水解度（）对酶解温度（）、酶解时间（）和酶添加量（）的二次回归方程＝13.65＋0.55＋0.51＋2.38- 0.19-0.21-0.13-0.942-0.362-0.502（1）

对试验所建立的回归模型进行方差分析，结果如表5所示。由表5中可看出，＝0.000 2＜0.01，达极显著水平，充分说明本试验对风味蛋白酶酶解效果所建立的模型显著回归；失拟项＝0.557 4＞0.05，不显著，说明本试验所建立的回归模型拟合度较高，能够真实地拟合响应面。相关系数2＝0.990 1，说明采用响应面法所建立的回归模型回归效果较好，有99.01%的响应值可用所建立的回归方程进行解释。此外，通过比较回归方程中一次项系数绝对值的大小，可看出3个因素对风味蛋白酶酶解效果的主次顺序依次为酶添加量（C）＞酶解温度（A）＞酶解时间（B）。

表5 响应面试验回归模型方差分析

注:值是方差齐性检查的结果；** 表示极显著水平（＜0.01)；* 表示显著水平（0.01＜＜0.05）

2.4.2 复合蛋白酶酶解牛骨肉蛋白浸提液的响应面优化

复合蛋白酶酶解温度（A）、酶解时间（B）和酶添加量（C）3个因素响应面中心组合试验设计及结果见表6。响应面试验回归模型方差分析见表7。

表6 响应面中心组合试验设计及结果

表7 响应面试验回归模型方差分析

注:值是方差齐性检查的结果；** 表示极显著水平（＜0.01）；* 表示显著水平（0.01＜＜0.05）

以酶解温度（）、酶解时间（）和酶添加量（）为自变量，水解度为响应值，对复合蛋白酶酶解试验结果进行多元回归分析，所建立的回归方程为＝11.53-0.031＋0.19＋1.28- 0.042＋0.021＋0.12-0.822-0.302-0.372

（2）经同样方法分析，以上所建立的回归模型回归效果较好，能够用于预测复合蛋白酶对牛骨肉蛋白提取液的酶解效果，3个因素对复合蛋白酶的酶解效果影响主次顺序依次为酶添加量（）＞酶解时间（）＞酶解温度（）。

2.4.3 工艺优化及验证试验

分析回归方程（1）和（2），得到风味蛋白酶的最佳酶解条件为酶解温度45℃、酶解时间4.3 h、酶添加量50 LAPU/g蛋白质，在此条件下预测水解度可达到15.59%；复合蛋白酶的最佳酶解条件为酶解温度45℃、酶解时间4.5 h、酶添加量15 000 U/g，在此条件下预测水解度可达到12.53%。通过3次验证试验，得到风味蛋白酶酶解液水解度为15.88%，复合蛋白酶酶解液水解度为12.78%，与模型预测值吻合度达到98%，因此本试验所建立的回归模型具有实际参考价值。酶解液中含有丰富的氨基酸、小分子肽，为肉类风味物质的形成提供前体物质，可进一步用于制备肉味香料[20-21]。

本试验仅研究风味蛋白酶或复合蛋白酶单一酶的酶解条件，两者结合起来是否效果会更好，还有待于进一步研究。

3 结论

本研究以牛骨肉蛋白液为底物，添加风味蛋白酶或复合蛋白酶对其进行酶解。在单因素试验结果基础上进行3因素3水平响应面分析试验，最终得到添加风味蛋白酶的最佳酶解条件是酶解温度45 ℃、酶解时间4.3 h、酶添加量50 LAPU/g蛋白质，在此条件下水解度达到15.88%。添加复合蛋白酶的最佳酶解条件是酶解温度45℃、酶解时间4.5 h、酶添加量15 000 U/g，在此条件下水解度达到12.78%。为后期进行美拉德反应制备肉味香料酶解方式的选择提供理论依据和数据支持，进而为副产物牛骨肉的深度开发提供新的利用途径。

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责任编辑：张爱婷

Optimization of Hydrolysis Conditions of Bovine Bone Protein Extract by Response Surface Methodology

FAN Xiao-pan, QIU Hong-bo, MA Li-zhenCorresponding Author

（Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, College of Food Science and Biotechnology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In this study, bovine bone were chosen as raw material (2.15% of crude protein content). Study on the influence of technological condition of enzymolysis by two kinds of protease (flavourzyme and protamex). The research results showed that the optimal hydrolysis conditions of flavourzyme were as follows: temperature 45 ℃, hydrolysis time 4.3 h and the enzyme addition 50 LAPU/g protein. Under this condition, the degree of hydrolysis was 15.88%. The optimum conditions for protamex extraction were found to be hydrolysis at 45 ℃ for 4.5 h with an enzyme/substrate ratio of 1 500 U/g, the degree of hydrolysis under this conditions was 12.78%.

bovine bone; enzymatic hydrolysis; flavourzyme; protamex; degree of hydrolysis

1008-5394（2017）03-0073-06

TS251.94

A

2016-11-29

天津市农业科技成果转化与推广项目“可食性牛羊骨素加工关键技术集成及工程化示范”（201604060）

樊晓盼（1993-），女，山西运城人，硕士在读，研究方向为动物源性食品安全与营养学。E-mail：308925471@qq.com。

马俪珍（1963-），女，山西运城人，教授，博士，研究方向为肉品科学与技术。E-mail：malizhen-6329@163.com。