貉源大肠杆菌耐药性的检测

冯 涛 薛 原

(东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040)

貉源大肠杆菌耐药性的检测

冯 涛 薛 原*

(东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040)

为了解大肠杆菌在黑龙江和吉林两个省份中健康貉的耐药情况，利用K-B纸片法对22种抗生素检测其大肠杆菌的敏感性。结果表明，貉源大肠杆菌的分离菌株表现出不同程度的耐药性。对头孢噻吩的耐药性最强(92.68%)，对氨苄西林、四环素的耐药率在60%以上，对亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素和多黏菌素B的敏感率均在90%以上。

貉；大肠杆菌；耐药性

近几年的时间内，养貉业在我国已成为不可忽视的产业，在毛皮养殖行业已取得重要的地位[1]。貉(Nyctereutesprocyonoides)的经济价值较高，发展的领域较大，而养貉的主要产品为貉皮，具有很强的御寒能力[2]。随着抗菌药物的广泛使用，在临床上大肠杆菌(Escherichiacoli)的耐药性也逐渐加强，与此同时也出现了多重耐药[3]。对于各养殖场的情况不一，使用抗生素的频率和种类也存在差异，不同养殖场的大肠杆菌的耐药情况也发生了不同的变化，耐药基因的传播同样影响着养貉业的发展。

因此，进行貉的耐药性研究具有长远的意义。本次的研究针对黑龙江和吉林两个省的养殖场的大肠杆菌耐药性进行调查和分析，旨在了解大肠杆菌的耐药性的现状与发展趋势，为控制貉对于不同种类的抗生素的耐药性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

药敏质控菌株大肠杆菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所。实验所用大肠杆菌在2016年5～7月从黑龙江和吉林两个省的貉的养殖场分离的大肠杆菌共56株，将经过分离和鉴定的菌株进行药敏试验。

1.1.2 培养基

水解酪蛋白琼脂培养基(Mueller-Hinton，MH)，杭州天和微生物试剂有限公司生产，批号120302。

1.1.3 药敏纸片

共22种，包括氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AML)、头孢噻吩(KF)、头孢他啶(CAZ)、阿莫西林/克拉维酸钾(AMC)、亚胺培南(IPM)、氨曲南(ATM)、庆大霉素(CN)、卡那霉素(K)、新霉素(NEO)、安普霉素(APR)、阿米卡星(AK)、诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、氧氟沙星(OFX)、四环素(TE)、强力霉素(DO)、氯霉素(C)、氟苯尼考(FFC)、复方新诺明(SXT)、多粘菌素B(PB)。药敏片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌的分离与鉴定

将新鲜貉的粪便样本接种于选择性培养基进行分离。在麦康凯琼脂培养基上，形成中等大小的粉红色菌落，在伊红美蓝琼脂培养基上，形成具有金属光泽的紫黑色菌落，在营养琼脂培养基上，形成中等大小的白色菌落。挑取多个菌落于LB液体培养基中培养，将菌液用30%的甘油混合并保存在-20℃中。根据生化特性鉴定分离的细菌为大肠杆菌。

1.2.2 药敏试验

采用WHO推荐的Kirby-Bauer法[4]。根据CLSI[4]的标准，只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株结果才有效。

1.2.3 判定标准

按抗菌药物敏感性试验扩散法[4]标准判定各菌株的耐药性，对所分离的细菌进行药敏试验。以敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐药(Resistant)3种形式对抑菌圈大小给予判定。

2 结果

2.1 大肠杆菌的耐药性

56株貉源大肠杆菌均可产生耐药性(图1)。对头孢噻吩、氨苄西林和四环素耐药率较高，达60%以上；对亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素和多黏菌素B高度敏感，敏感率达90%以上 。

图1 貉源大肠杆菌对22种抗生素的药敏试验结果Fig.1 The antimicrobials resistances of Escherichia coli isolated from Nyctereutes procyonoides

2.2 大肠杆菌的多重耐药性

56株貉源大肠杆菌对22种抗菌药物均存在耐药性，表现对1种或1种以上药物耐药。3耐菌株所占比例最大为14.28%。分离菌株存在多重耐药现象，最少为3种，最多为13种(图2)。

图2 貉源大肠杆菌的多重耐药性Fig.2 Multiple antibiotic resistance of Escherichia coli isolated from Nyctereutes procyonoides

2.3 大肠杆菌的耐药类型

貉源大肠杆菌中，耐药类型多样(表1)。

表1 貉源大肠杆菌的耐药谱型

Tab.1 The resistance spectrum of the Nyctereutes procyonoides

续表1

3 讨论

在本次研究过程中，貉大肠杆菌对本试验所采用的22种抗生素有不同程度的耐药性，其中最少的耐药性仅有1种，最多的耐药性为13种，比例较高的为3重耐药，耐3种抗生素的占总数的14.28%，且3重及3重耐药以上的菌株共有45株，所占比例可达80.36%。这些结果说明黑龙江和吉林地区貉的养殖场在治疗疾病时，用药情况较为复杂，多重耐药情况较为明显，但对单一抗生素的耐药性并不普遍，大肠杆菌在该地区使用的抗生素种类较多，在药物选择压力下逐渐发展为多重耐药的菌株[5]。

大肠杆菌耐药性的结果表明，黑龙江和吉林地区貉的大肠杆菌仅对头孢噻吩的耐药率达到80%以上，氨苄西林、四环素和氯霉素在50%以上，这些抗菌药物在该地区的养貉业中多为临床常用药物[6]，从而造成了耐药性的产生，张召兴等[7]对秦皇岛地区貉大肠杆菌进行了药敏试验，发现大肠杆菌对氟苯尼考、新霉素、庆大霉素、多黏菌素的敏感性较强，与本次实验药敏结果基本相似。而对亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素和多黏菌素B高度敏感，均达90%以上，这些在临床上不常使用的药物敏感性强，尤其是阿米卡星和多黏菌素B的耐药性均为0，可以逐渐在临床上应用，以便缓解当下耐药性较高的影响。以上研究都表明，我国大肠杆菌多重耐药性比较严重，耐药菌存在数目较多，菌株间还可能存在克隆垂直或水平传播，这些对环境安全都会产生较大的影响。因此要定期及时地开展耐药性的检测工作，掌握耐药菌株的发展趋势，以便更加合理有效地控制抗生素的使用。

貉作为经济价值比较高的毛皮动物，貉皮不仅具有国内市场，在国际市场上也得到了很高的重视[1]。因此，为了养貉业的更好发展，对貉的耐药性进行及时的流行病学调查十分重要。养殖人员在饲养过程中，应该尽量减少使用抗菌药物，这样既达到抗菌效益，又可以减少貉对抗生素产生耐药机制。对于貉之类的毛皮动物，一方面应使用治疗效果具有针对性的抗菌药物，并且定期更换抗菌药物种类，或者采取联合用药，这样可以很好地控制耐药性出现和发展[8]；另一方面需要养殖场加强管理制度，建立适宜健康的饲养和卫生设备，进而减少耐药基因在同一菌群和不同菌群之间的传播，才能促进毛皮业的正常发展。

[1] 华树芳，华盛.我国养貉业的发展历程、现状和展望[J].特种经济动物，2010(4)：2-4.

[2] Lawler D F，Evans R H，Nieminen P，et al.Lessons from a non-domestic canid：joint disease in captive raccoon dogs(Nyctereutesprocyonoides).[J].Veterinaria Italiana，2012，48(4)：367-378.

[3] Schwarzer A，Kaesberg A K，Bergmann S，et al.Activity rhythms and use of nest boxes of juvenile mink in seminatural group housing[J].Journal of Veterinary Behavior：Clinical Applications and Research，2017，18：13-22.

[4] Clinical and laboratory standards institute(CLSI).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[C]25th Informational Supplement.Document M100-S25，Wayne，PA：CLSI，2015.

[5] Bonnet R.Growing group of extended-spectrum beta-lactamases：the CTX-M enzymes[J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48(1)：1-14.

[6] Lalak A，Wasyl D，Zajac M，et al.Mechanisms of cephalosporin resistance in indicatorEscherichiacoliisolated from food animals[J].Veterinary Microbiology，2016，194：69-73.

[7] 张召兴，李蕴玉，张艳英，等.秦皇岛地区貉源E.coli的分离鉴定与耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2016(6下)：175-177.

[8] Bessalah S，Fairbrother J M，Salhi I，et al.Antimicrobial resistance and molecular characterization of virulence genes，phylogenetic groups ofEscherichiacoliisolated from diarrheic and healthy camel-calves in Tunisia[J].Comparative Immunology，Microbiology and Infectious Diseases，2016，49：1-7.

Analysis of Antimicrobial Resistance inEscherichiacolifrom Raccoon Dog(Nyctereutesprocyonoides)

Feng Tao Xue Yuan*

(College of Wildlife Resources,Northeast Forestry University,Harbin,150040,China)

We tested the susceptibility ofEscherichiacolito 22 antimicrobial agents using the agar diffusion test to investigate the diversity of antimicrobial resistance ofE.colifrom Raccoon dog(Nyctereutesprocyonoides)in Heilongjiang and Jilin provinces in northeast China.The strains ofE.coliisolated from raccoon dog sustained varying degrees of resistance.Resistance to cephalothin was the highest(93%)，that to ampicillin and tetracycline was over 60%.Susceptibilities to imipenem，amikacin，gentamycin and polymyxinB were all above 90%.

Nyctereutesprocyonoides；Escherichiacoli；Antimicrobial resistance

稿件运行过程

2017-03-13

修回日期：2017-04-25

发表日期：2017-08-10

S858.9

A

2310-1490(2017)03-498-03

国家自然科学基金(31502119)；黑龙江省博士后科研启动金(LBH-Q14002)

冯涛，女，21岁，本科生；主要从事细菌耐药性方面的研究。

*通讯作者：薛原，E-mail：xueyuan-1978@163.com