SPME—GC—MS法测定小鳄龟肉中关键风味化合物的响应面法优化

张同刚+范玲

摘 要：以小鳄龟肉为原料，通过单因素试验及响应面分析优化小鳄龟肉中挥发性风味化合物的萃取条件，采用顶空固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术检测并分析小鳄龟肉中的挥发性风味物质，同时结合化合物的感觉阈值，利用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）法确定关键风味化合物。结果表明：小鳄龟肉中挥发性风味化合物的最佳萃取条件为萃取时间25 min、萃取温度60 ℃、样品添加量1.0 g。在此萃取条件下，从去皮及带皮小鳄龟肌肉中分别检测出33 种和37 种挥发性风味物质，且关键风味化合物种类基本相同，主要是D-柠檬烯、壬醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、苯乙醛、庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇、二甲基硫醚及2-乙基呋喃等化合物，它们共同决定了小鳄龟肌肉的整体风味。

关键词：小鳄龟肉；响应面分析；固相微萃取；气相色谱-质谱联用；关键风味化合物

Optimization of Solid-Phase Microextraction Conditions by Response Surface Methodology for Gas Chromatography-Mass Spectrometry Determination of Key Flavor Compounds in Chelydra serpentina Muscle

ZHANG Tonggang， FAN Ling*

（School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： A solid-phase microextraction （SPME） procedure for the determination of volatile compounds in Chelydra serpentina muscle by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was presented. The extraction conditions were optimized using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The key flavor compounds were determined by their sensory threshold and relative odor activity value （ROAV）. The results showed that the optimal extraction conditions were determined as follows： extraction time 25 min， extraction temperature 60 ℃ and sampling weight 1.0 g. Under these optimized conditions， a total of 37 and 33 volatile flavor compounds were found in Chelydra serpentina muscle with and without skin， respectively. The key flavor components in both samples were basically the same， mainly including heptyl aldehyde， 3-methyl butanal，3-methylthiopropanal， phenylacetaldehyde，1-octene-3-alcohol， D-limonene， nonanoic acid， hexanal， dimethyl sulfide， （Z）-4-heptenal， and 2-ethyl-furan.

Key words： Chelydra serpentine muscle； response surface methodology； solid phase microextraction； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）； key flavor compounds

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708007

中圖分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）08-0034-05

小鳄龟（Chelydra serpentina），又名蛇鳄龟，隶属爬行纲、龟鳖亚纲、龟鳖目、曲颈龟亚目、鳄龟科、鳄龟属，原产于北美洲地区，90年代后期作为宠物龟少量引入我国[1]。小鳄龟具有抗病能力好、生长速度较快、体型相对较大、壳薄肉多等特点，其肉质肥美、细腻、营养丰富、无异味，具有很高的经济和食用价值[2]。目前，对小鳄龟的温室养殖、人工繁殖、性别决定、饵料偏好等方面已进行过一些研究[3-9]，刘翠娥等[10]研究了小鳄龟的含肉率和肌肉中的营养成分，证实小鳄龟肉是一种高蛋白、低脂肪的优质肉类。但小鳄龟肉风味方面的相关报道较少。

本研究以人工养殖小鳄龟为研究对象，采用顶空固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技术与气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术结合测定小鳄龟肌肉中的挥发性风味物质，首次结合感觉阈值，利用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）[11-14]确定小鳄龟肉的关键风味成分，为小鳄龟肉制品的进一步开发与研究提供理论参考。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

实验用鳄龟购自广东省顺德区炜杰龟鳖养殖场，共4 只，雌性，二龄龟，体质健壮、无病害，平均体质量（3 300±20） g。宰杀取肉，用蒸馏水清洗后分别装入保鲜袋中，-80 ℃超低温冰箱速冻保存。

1.2 仪器与设备

JJ-2（2003-61）气相色谱-质谱联用仪、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取头（65 μm） 日本岛津公司；HH.SY21-Ni6-C高速组织捣碎机 江苏金坛市亿通电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验设计

选择萃取时间分别为15、20、25、30、35 min（萃取温度60 ℃，样品添加量1.0 g），萃取温度分别为50、55、60、65、70 ℃（萃取时间25 min，样品添加量1.0 g），样品添加量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g（萃取时间25 min，萃取温度60 ℃），研究不同因素对去皮小鳄龟肉中挥发性风味物质萃取效果的影响。

1.3.2 响应面优化试验设计

结合单因素试验结果，进行三水平三因素响应面优化试验，对去皮小鳄龟肉中挥发性风味物质的萃取条件进行优化。

1.3.3 样品挥发性风味物质提取

样品预处理：将去皮及带皮小鳄龟肌肉样品放入高速组织捣碎机中制成糜状，备用。

样品的SPME：参考文献[15]中的方法，并稍作修改。将4 g肌肉样品置于20 mL透明玻璃顶空瓶中，加入0.6 g氯化钠，混合均匀，80 ℃恒温水浴15 min；把SPME针头插入顶空瓶中对样品进行萃取，15 min之后将萃取纤维头取出，插入GC-MS仪进样口，脱附3 min后，开始检测。

1.3.4 样品挥发性风味物质检测

GC条件：参考文献[15]中的方法，并略作修改。Agilent DB-5MS检测柱（30 m×0.25 mm，0.5μm），He为载气，设定流速为3.7 mL/min，不分流；进样器温度250 ℃，氢火焰离子化检测器（hydrogen flame ionization detector，FID）温度250 ℃，检测柱初温50 ℃，保持2 min，以15 ℃/min的速率升溫至100 ℃，再以6 ℃/min的速率升温至210 ℃，保持10 min，之后以10 ℃/min的速率升温至260 ℃，再以5 ℃/min的速率升温至280 ℃。

MS条件：GC-MS接口温度250 ℃，质谱质量扫描范围20～450 u[15]。

1.3.5 关键挥发性风味物质的ROAV测定

采用ROAV法，把样品中对风味贡献最大组分的ROAV赋值为100（ROAVstan=100），其余风味物质的ROAV按照下式计算。

式中：Cri为各组分的相对含量/%；Ti为各组分的感觉阈值/（μg/kg）；Crstan为对样品整体风味贡献最大物质的相对含量/%；Tstan为对样品整体风味贡献最大物质的感觉阈值/（μg/kg）。

1.4 数据处理

采用峰面积归一化法计算各挥发性风味物质的相对百分含量，采用SPSS 17.0软件和Origin 8.0软件进行数据处理和绘图，通过美国国家科学技术研究所出版的NIST05a.L质谱谱库对化合物定性。

2 结果与分析

2.1 响应面优化试验结果

2.2.1 Box-Behnken试验

结合以总峰面积为评价指标的单因素试验结果，选择萃取时间为20、25、30 min，萃取温度为55、60、65 ℃，样品添加量为0.5、1.0、1.5 g，以总峰面积作为响应值，进行三水平三因素响应面优化试验，试验因素水平与结果如表1所示。

利用Design Expert 8.0软件对表1中的数据进行分析，得到二次多项式回归模型：Y=-13.67+21.35A+

10.96B-6.52C+3.04AB-0.52AC-6.01×10-3BC+0.58A2-1.03B2-0.27C2。由表2可知，二次多项式回归模型显示出极显著水平（P<0.01），说明所得回归方程与实际情况的吻合度较好；C、B2和C2对实验结果影响极显著（P<0.01），各因素对总峰面积影响的大小顺序为萃取时间>样品添加量>萃取温度。

由图1可知，当萃取时间为24.86 min、萃取温度为60.14 ℃时，去皮小鳄龟肉样品中挥发性风味物质的总峰面积达到最大值；由图2可知，当萃取时间为24.86 min、样品添加量为1.02 g时，总峰面积达到最大值；由图3可知，当样品添加量为1.02 g、萃取温度为60.14 ℃时，总峰面积达到最大值。综上所述，去皮小鳄龟肉样品中挥发性风味物质的总峰面积达到最大值时的萃取条件为萃取时间24.86 min、萃取温度60.14 ℃、样品添加量1.02 g。

2.2.2 模型验证

当选取萃取条件为萃取时间24.86 min、萃取温度60.14 ℃、样品添加量1.02 g时，去皮小鳄龟肉中挥发性风味物质的总峰面积预测值为1.562×106。考虑到实验操作的方便性，对萃取条件进行适当调整，选择萃取时间为25 min、萃取温度为60 ℃、样品添加量为1.0 g进行5 次平行实验，总峰面积平均值为1.489×106。预测值与实验值的误差为1.46%，说明本研究得到的小鳄龟肉中挥发性风味物质的最佳萃取条件可行性较好。

2.2 小鳄龟肉中挥发性风味物质的测定

在最佳萃取条件下，采用SPME与GC-MS联用，得到去皮及带皮小鳄龟肉中挥发性风味物质的总离子流图，如图4～5所示。其中去皮小鳄龟肉中挥发性风味物质的总峰面积为1.489×106。endprint

由表3可知，去皮及带皮小鳄龟肉中分别检测出33 种和37 种挥发性风味化合物，相同成分共有8 类、23 种，分别是烃类、醛类、醇类、酮类、醚类、酯类、酸类和杂环类化合物。挥发性风味物质的含量与风味特征没有直接关系，小鳄龟肉的整体风味由挥发性风味物质的感觉阈值和相对含量共同决定。壬醛在去皮及带皮小鳄龟肉中的相对含量均较高，且感觉阈值相对较小（1.0 μg/kg），对小鳄龟肉的整体风味贡献最大，因此定义壬醛的ROAVstan=100.00，其他挥发性风味物质的ROAV由1.3.5节中的公式计算得到。所有可测得ROAV的物质均满足0≤ROAV≤100.00，ROAV越大的组分对样品整体风味的贡献率也越大，其中ROAV≥1.00的组分为样品的重要风味成分，0.10≤ROAV≤1.00的组分为样品中比较重要的风味成分。小鳄龟肉的主体风味物质由D-柠檬烯、壬醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、苯乙醛、庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇、二甲基硫醚及2-乙基呋喃等构成，因此小鳄龟肉的主体风味物质主要是醛类物质；2-甲基萘、苯乙酮、乙酸丁酯及2-乙酰基噻唑等化合物对小鳄龟肉的整体风味有比较重要的影响。

肉中的烃类物质主要来自脂肪酸烷氧自由基的均裂，烃类物质同时也是某些杂环化合物的重要前体物质，对整体风味有重要作用[16]；大部分醛类物质来自肉中脂肪酸的氧化分解，是对肉制品风味贡献最大的一类挥发性风味成分[17-20]，饱和直链醛（如壬醛、庚醛和己醛等）在小鳄龟肉的挥发性风味物质中占较大比例，对小鳄龟肉腥味的产生起着重要作用，己醛是由肉中的亚油酸氧化形成的，目前己醛已经是评价肉制品氧化程度与风味的可靠指标；醇类物质对风味的影响不如醛类物质显著，但也对整体风味有关键贡献[21]；酯类物质通常是由肌肉中的脂肪氧化所产生的游离脂肪酸与醇类物质相互作用产生的；而酮类物质则由不饱和脂肪酸的热降解或氧化降解产生，感觉阈值较高，对肉品风味的贡献较小[22]。

具有鱼腥味的庚醛和己醛在带皮小鳄龟肉中的含量高于去皮小鳄龟肉，带皮小鳄龟肉的异味大于去皮小鳄龟肉，因此小鳄龟皮可能是小鳄龟肉腥味的主要来源之一。这一结论能够为减少小鳄龟肉产品中的异味（腥味）提供依据和参考，使此类产品能被更多的消费者所接受。

3 结 论

本研究采用SPME-GC-MS法，通过单因素试验和响应面优化试验，得出提取小鳄龟肉中揮发性风味物质的最佳条件为萃取时间25 min、萃取温度60 ℃、样品添加量1.0 g。在此萃取条件下，利用各挥发性化合物的ROAV推断小鳄龟肉的关键风味成分，结果表明，小鳄龟肉的主体风味物质由D-柠檬烯、壬醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、苯乙醛、庚醛、己醛、

1-辛烯-3-醇、二甲基硫醚及2-乙基呋喃等化合物构成，并推测小鳄龟皮可能是小鳄龟肉腥味的主要来源之一，为小鳄龟肉制品的进一步开发与研究提供参考。

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