MIT3、抗gp210和抗sp100联检在原发性胆汁性肝硬化诊断中的价值

宋继英 李爽 刘丹秋 王福义 王岑 邓金贵 黎明新

MIT3、抗gp210和抗sp100联检在原发性胆汁性肝硬化诊断中的价值

宋继英 李爽 刘丹秋 王福义 王岑 邓金贵 黎明新

目的 比较新型研发的PBC筛查试剂盒与单个MIT3，以及2个抗核抗体（ANA）gp210和sp100 ELISA 检测试剂盒在中国人群中PBC诊断的性能。方法 使用PBC screen ELISA筛查试剂盒和单独针对MIT3、gp210和sp100抗原的ELISA试剂盒，对95例确诊PBC患者、125例非PBC患者（自身免疫性肝炎/原发性硬化性胆管炎18例，病毒性肝炎32例，其他肝脏疾病 21例），以及健康人54例的血清样本进行检测。结果 PBC Screen ELISA 法检测敏感性为76.8%，特异性为95.2%。特异性与结合单独ELISA 法检测MIT3、gp210和sp100抗体的特异性96.0%相当。在32例用间接免疫荧光（indirectimmunofluorescence，IIF）检测为阴性的PBC患者中，有15（46.9%）例PBC Screen ELISA 检测结果为阳性。结论 PBCScreen ELISA是理想的一线PBC筛查试剂，尤其对于IIF筛查为阴性的PBC患者展现出优良的评估性能。

原发性胆汁性肝硬化 自身免疫性肝炎 原发性硬化性胆管炎 抗GP210 抗SP100

原发性胆汁性肝硬化（PBC）是以肝内胆小管破坏为特征的慢性胆汁淤积性自身免疫性疾病[1]，其血清学标志抗体是抗线粒体抗体（AMA）[2]。此外，抗核抗体（ANA）gp210和sp100约存在于25% 的PBC患者中[3]。本研究采用一种新型的能联合检测MIT3、gp210和sp100抗体的PBC试剂盒对PBC和非PBC患者血清进行检测，同时用单独的MIT3、gp210和sp100抗体检测试剂盒测试，比较联合检测和单独检测的相关性，及其对PBC诊断的价值。

材料与方法

1 材料 回顾性分析2013年6月～2015年9月在沈阳医学院附属中心医院住院及门诊拟诊或待排除PBC患者资料220份，依据国际公认的美国肝病学会（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）2000年制定的诊断标准作为PBC确诊标准[1]：①碱性磷酸酶（ALP）等反映胆汁淤积的生化指标升高；②血清AMA或AMA-M2阳性（滴度＞1∶40）；③AMA-M2阴性，肝组织病理学诊断有非化脓性胆管炎和中小胆管破坏。同时排除病毒性肝炎、酒精性及药物性肝损伤。220例患者最后确认为PBC95例，其余125例为非PBC患者。

2 方法

2.1 PBC 筛查：采用Quanta Lite PBC Screen IgG/IgA ELISA（INOVA Diagnostics）定量检测血清样本中针对MIT3、gp210和Sp100的IgG/IgA自身抗体。具体步骤：将100 µl 1∶100稀释的血清加到包被有亲和纯化的PDC-E2、BCOADC-E2、OGDC-E2抗原，以及针对sp100和gp210免疫显性表位的合成多肽混合物的ELISA板孔中，室温反应30 min。清洗3遍，每孔加100 µl过氧化物酶耦联的山羊抗人免疫球蛋白IgG/IgA，室温孵育30 min。清洗3遍后，每孔加100 µl 3，30，5，50-四甲基联苯铵，室温反应30 min，加100 µl、0.344 mol/L H2SO4终止液终止反应。于 450/620 nm处读取结果。试剂盒操作手册中推荐的cutoff值为25 U。阳性结果提示在PBC Screen中，血清样本中至少有1种针对靶抗原的抗体。阴性结果提示血清样本中没有针对MIT3、gp210和sp100的抗体或相应抗体的水平低于cut off值。

2.2 单独的 MIT3、gp210和sp100特异性ELISA检测：为评估单独的MIT3、gp2 1 0和sp1 0 0 ELISA检测结果和PBC Screen检测结果的一致性，PBC患者和对照组的血样同时分别用M2 EP（MIT3）、gp210和sp100 IgG Quanta Lite®ELISA（INOVA Diagnostics）试剂盒进行测试。按照操作指南严格执行。单独ELISA 检测的实验操作步骤和PBC Screen一致，但二抗使用的是过氧化物酶耦联的山羊抗人免疫球蛋白IgG。

3 统计学处理 分别计算PBC Screen ELISA 筛查以及抗MIT3、抗SP100和抗gp210诊断PBC的敏感度、特异度。应用SPSS 13.0软件分析PBC Screen ELISA筛查和单项ELISA检测及间接免疫荧光（IIF）之间的Kappa值。计数资料用百分比表示；计量资料用均数±标准差表示。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 一般资料 共检测220例血清标本，其中95例来自确诊PBC患者，125例来自非PBC患者，包括自身免疫性肝炎/原发性硬化性胆管炎18例、病毒性肝炎32例，其他肝脏疾病21例以及健康人54例。PBC患者男女比例为1∶6.1（31/189），平均年龄（50.2±13.1）岁。自身免疫性肝炎16例，其中6例原发性胆汁性肝硬化合并自身免疫性肝炎；原发性硬化性胆管炎2例；病毒性肝炎中包括25例乙型病毒性肝炎和7例丙型病毒性肝炎；其他肝脏疾病包括5例酒精性肝病、9例病源不明的肝脏疾病、7例药物诱导产生的肝病。

2 PBC Screen ELISA诊断PBC的敏感性和特异性分析 根据试剂盒操作手册中推荐的cut off值，PBC Screen ELISA检测PBC患者的敏感性为76.8%，特异性为95.2%。95例PBS患者中，采用IIF法检测出AMA抗体阳性63例，检测敏感性为66.3%。用PBC Screen ELISA分别筛查IIF为阳性和阴性的PBC患者样本，阳性率分别为93.6% 和46.9%。在诊断为PBC合并AIH的6例患者样本中，5例用PBC Screen ELISA检测后结果为阳性。在分别诊断为AIH/PSC（18）、病毒性肝炎（32）、其他肝病（21），以及健康对照（54），用PBC Screen ELISA筛查结果为阳性的比例分别为：1/18（5.5%），2/32（6.25%），1/21（4.7%），1/30（3.3%），1/54（1.8%）。健康对照组的PBC Screen ELISA 检测平均值为4.4 U；在非PBC对照疾病组和健康对照组中，PBC Screen ELISA 检测结果为阳性的6例中，只有2例（1例乙肝患者，1例AIH患者）检测结果的值超过100 U。

3 PBC患者中针对单个MIT3、gp210 和sp100检测的ELISA结果 95例PBC患者血清中，有69 例血清（72.6%）MIT3检测阳性，16例（16.8%）gp210和14例（14.7%）sp100检测阳性。另外，有6例血清（6.3%）MIT3和gp210检测双阳性，5例血清（5.3%）MIT3和sp100检测双阳性，3例血清（3.2%）sp100和gp210检测双阳性，4例血清（4.2%）MIT3、sp100和 gp210检测均为阳性。单独ELISA检测敏感性为81.1% （表1）。

4 PBC Screen ELISA试剂盒在IIF检测结果为阴性的PBC患者中的优势 95例PBC患者中，有32例IIF检测结果为阴性。若用IIF法作为PBC诊断标准，这32例PBC患者会被漏检。用PBC Screen ELISA 试剂盒检测这32例IIF结果阴性的PBC患者血清，结果显示15例（46.9%）阳性。若单独用MIT3、gp210 和sp100ELISA试剂盒检测这32例样本，有16例（50%）血样至少有1个检测指标为阳性。其中13例血样（81.25%）MIT3阳性，5例（31.25%） gp210和5 例（31.25%） sp100阳性。另外，有2例血清（12.5%）MIT3和gp210为双阳性，2例血清（12.5%）MIT3和 sp100双阳性，1 例血清（6.25%）sp100和 gp210双阳性，1例血清（6.25%）MIT3、sp100和 gp210检测结果均为阳性。

表1 PBC Screen在cut off值为25.0时的诊断特点

在6 3例I I F检测结果为阳性的P B C患者中，PBC Screen的阳性率为93.7%，用3种抗原单独ELISA检测，阳性率为96.8%。有56例（88.9%）MIT3阳性，11例（17.5%）gp210和9例（14.3%） sp100阳性。另外，有4例（6.3%）MIT3和 gp210双阳性，3例（4.8%）MIT3和sp100双阳性，2例（3.2%）sp100和gp210双阳性，3例（4.8%）MIT3、sp100和gp210检测结果均为阳性（图1）。

图1 PBC样本中特异性抗体的检测

5 PBC Screen ELISA检测和单个ELISA及IIF检中，PBC Screen 检测敏感性比单独用MIT3 IgG ELISA检测敏感性要高，分别是46.9% 比40.6%（P＜0.05）。对IIF检测为阳性的PBC患者，PBC Screen 的敏感性和单独用MIT3 IgG ELISA检测相比分别是93.7%和88.9%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。测结果一致性的比较 所有PBC患者和对照组血样均进行单个ELISA检测。所有PBC血样均做IIF检测。IIF检测PBC的敏感性和特异性分别为66.3%和93.9%，PBC Screen检测敏感性为76.8%，明显高于IIF（P＜0.01），特异性的差异无统计学意义（P＞0.05）。在32例IIF检测AMA结果阴性的PBC患者中，有15例PBC Screen ELISA筛查AMA结果为阳性。3 例PBC患者经IIF检测为阳性，但PBC Screen检测为阴性。比较PBC Screen 和IIF检测的一致性，Kappa值为0.562。见表2。

比较PBC Screen和单独ELISA检测的一致性为96.8%，Kappa值为0.903。95例PBC患者中，3例PBC Screen和单独ELISA检测结果不一致。3例单独ELISA检测为阳性，但PBC Screen检测为阴性。

对于IIF检测AMA 结果为阴性的PBC患者，PBC Screen和单独ELISA相结合的检测结果比较，敏感性分别为46.9%和50.0%，差异无统计学意义（P＞0.05）。IIF检测AMA为阴性的PBC患者

表2 PBC Screen，结合的单项ELISA 测试及IIF检测符合率比较

讨 论

原发性胆汁性肝硬化是以肝内胆小管破坏为特征的慢性胆汁淤积性自身免疫性疾病。进展性胆管破坏会导致肝脏功能性缺失逐渐加重，且随时间的推移可能会导致肝脏功能不全，严重时甚至需要肝脏移植。PBC的血清学标志是抗线粒体抗体，并且在高达90%～95%的PBC患者中可检测到[2]。针对抗线粒体抗体的主要自身抗原为丙酮酸脱氢酶复合体的E2亚单位（PDC-E2）、支链2-氧酸脱氢酶复合物（BCOADC-E2）和2-氧-戊二酸脱氢酶复合体（OGDC-E2）。Gershwin和Leung发现并且申请专利保护了一种重组抗原（MIT-3），后者包含上述3种亚单位的免疫决定性抗原决定簇[3]。除抗线粒体抗体（AMA）外，来源于PBC患者血清中约有50%～72%包含有抗核抗体（ANA）。与PBC特异性相关的2种抗核抗体模式是以核周膜蛋白gp210为特征的加强核周/核膜染色模式及以核小体相关sp100为特征的多核（MND）模式[4，5]。抗gp-210抗体和抗sp100抗体约存在于25%的PBC患者中，且具有高度特异性。此外，这些抗体也存在于10%～50%抗线粒体抗体阴性的PBC患者中，是仅能检测到的特异性抗体[6]。PBC的发病率呈现逐年上升趋势，但由于其临床症状和其他慢性肝病相似，易造成误诊和漏诊。因此发现对PBC有特异性诊断价值的血清学检测标志物和标准化检测方法成为国内外研究重点。现阶段对线粒体抗体（M2）的检测研究较多，但是对更加灵敏的专利抗原MIT3及另外2个血清标记物联合检测的研究还较少[7-14]。

表3 PBC Screen，结合的单项ELISA 测试及MIT3 ELISA 敏感性和特异性比较

2010年由意大利IRCC的自身免疫肝病中心主导了一个全球性多中心研究，通过对1 175例PBC患者和1 232例对照组样本用一种新型的能联合检测MIT3、gp210和sp100抗体的PBC试剂盒检测，且同时用单独MIT3、gp210和sp100抗体检测试剂盒测试，比较联合检测和单独检测的相关性，结果[15]证明联合检测筛查试剂盒的灵敏度更高，可作为PBC实验室检测的常规一线筛查试剂。

国内对PBC的相关研究多集中在临床病例分析上，对特异性检测指标的研究较少。对中国PBC患者人群的血清学指标诊断价值的研究非常有必要，将为临床PBC诊断提供更高灵敏度和特异性的指标。本研究中的新型PBC检测试剂盒与以往PBC ELISA检测试剂盒的不同之处在于，除检测3个主要的线粒体抗原表位外，还可以同时检测针对抗核抗体的2个蛋白GP210和SP100；且检测的血清型除IgG还包含IgA。

虽然PBC筛查试剂盒检测的是针对抗线粒体多个抗原的抗体混合物，其在检测结果的可靠性上与单个检测ELISA试剂盒相比毫不逊色。尤其是用于IIF法检测抗AMA 阴性PBC确诊患者时表现突出。PBC筛查试剂盒的高敏感性降低了没有血清学证据的PBC患者的数目。除检测IgG型MIT3、gp210和sp100，还可检测IgA型，IgA型AMA在PBC诊断中具有特殊的病理作用。因为血清IgA是粘膜免疫系统中主要的免疫球蛋白，在胆汁中也是主要的蛋白[16，17]。虽然IgA的出现不如IgG频繁，但有些情况下，IgA型抗体是PBC患者中唯一出现的血清类型且保持着较高的浓度。在PBC的临床早期阶段，往往可以观测到IgA型AMA[18，19]。PBC筛查试剂盒的特异性并未因检测多种抗原而降低。在125例对照组样本中，有3例PBC 筛查阳性结果来自AIH样本，其中1例PBC筛查为强阳性。临床资料显示，AIH患者中血清学AMA阳性但无PBC临床症状的情况约占5%～34%。本研究中的比例是18.8% （3/16）。

迄今为止尚无PBC诊断的金标准。本评估结果显示，PBC筛查结果与单个ELISA检测相比，具有相同的敏感性和特异性。PBC 筛查试剂盒的优势在于可以把临床上IIF法漏检的AMA阴性PBC患者重新检出来，并提供明确的血清学证据，从而加速PBC的诊断和治疗。与传统IIF相比，PBC筛查法快速、简单、客观，对评估人员的检测经验没有过高的要求。当IIF法检测PBC患者结果是阳性时，可以更好地确认PBC相关核型。但若结果是阴性，不易判断这是由于IIF的敏感度低还是血清中的确不存在PBC特异性抗体造成的。而PBC ELISA筛查后阳性结果，则可以用单项ELISA做进一步确认。单项特异性ELISA检测对于临床意义的判断也越来越重要，如gp210抗体阳性PBC患者可能患有严重的肝病和较差的预后。

我们的结果显示可以把PBC ELISA筛查试剂盒做为PBC诊断的一线筛查试剂。由于操作半自动化和判读客观，也可以用于临床实验室的常规检测。对于PBC诊断，尤其是用IIF阴性样本，PBC 筛查试剂盒展现出明显的优势。联合检测PBC的特异性标志物抗MIT3、gp210和sp100抗体，将为疑似原发性胆汁性肝硬化患者提供一种非常有效的检测工具。

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Ob jective To Detect antibodies against mitochondrial and nuclear antigens for diagnosis of primary biliary cirrhosis （PBC） and to compare the performance of the PBC Screen to the combined performance obtained with individual IgG ELISAs to MIT3，gp210，and sp100 in the patients with PBC. Methods The PBC Screen and individual antibodies to MIT3，anti-gp210，and anti-sp100 were measured in sera of 220 individuals. Final diagnosis of PBC had been made in 95 of the participants and the rest included individuals with autoimmune hepatitis （AIH）/ primary sclerosing cholangitis （18 cases），viral hepatitis（32 cases），or other liver diseases （21 cases），and healthy controls（54 persons）. Results The PBC Screen at the cutoff of 25 units had an overall sensitivity of 76.8%，specificity of 95.2%，similar to the specificity of 96.0% obtained by the combined results of individual MIT3，sp100，and gp210 IgG ELISAs.Of the 32 PBC patients without AMA detected by indirect immunofluorescence（IIF），15（46.9%） were positive for PBC-specific autoantibodies. Conclusions The PBC Screen is an ideal first-line test for the diagnosis of PBC，especially for those who showed negative IIF.

Primary biliary cirrhosis Autoimmune hepatitis Primary sclerosing cholangitis Anti-GP210 Anti-SP100

R657.3+1 R446.11

A

1671-2587（2017）05-0470-05

The Value of a Combination Detection of Anti-MIT3，Anti-gp210 and Anti-sp100 in the Diagnosis of Primary

Biliary Cirrhosis SONG Ji-Ying，LI Shuang，LIU Dan-qiu，et al.Affiliated centeral Hospital of Sheng yang medical university 110024

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.019

110024 辽宁省沈阳医学院附属中心医院

宋继英（1980–），女，辽宁沈阳人，主管检验师，硕士，主要从事医学检验工作，（Tel）13840329908（E-mail）songjiying226@sohu.com。

黎明新，男，主任检验师，硕士，（Tel）18002477229（E-mail）lmx1124@sina.com。

2017-02-02）

（本文编辑：潘健）