血浆EB病毒DNA浓度检测在初诊鼻咽癌患者分期中的应用

凡任芝

血浆EB病毒DNA浓度检测在初诊鼻咽癌患者分期中的应用

凡任芝

目的 探讨血浆EBV DNA浓度检测在初诊鼻咽癌患者诊断分型中的应用价值。方法 按肿瘤淋巴结转移（Tumor Node Metastasis，TNM）进行临床分期，对57例初诊鼻咽癌患者用荧光定量PCR技术检测血浆内EBV DNA浓度。结果 EBV DNA阳性率与患者的性别及年龄段均无相关性；TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的EBV DNA浓度检测结果的差异有统计学意义（P＜0.05），且Ⅳ期较高；随T分期的发展，各期EBV DNA阳性检出率增高，T2和T4期EBV DNA浓度检测结果的差异有统计学意义（P＜0.05），且T4期较高；M和N分期患者的差异无统计学意义。结论 血浆EBV DNA浓度水平变化与鼻咽癌患者的临床分期呈正相关，可以作为一种初诊鼻咽癌患者的辅助诊断手段。

实时荧光定量PCR 鼻咽癌 EB病毒

早在1 9 9 8年Mutirrangura等就研究发现EB病毒（epstein-barr virus，EBV）与鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma NPC）的发生、发展和转归等呈现出一定的相关性[1]，且有研究表明完整的EBV能诱发人鼻咽粘膜上皮细胞发生癌变[2，3]，EBV和NPC间的关系一直是研究热点，越来越多的研究表明EB病毒含量与鼻咽癌临床分期、肿瘤负荷等病情相关。为此，本研究采用荧光定量PCR方法，对初诊NPC患者血浆中EBV DNA的浓度水平进行检测，分析量化的病毒浓度与患者性别、年龄等基础参数的关系，并深入分析与现行的TNM标准间的关系，为下一步深入研究NPC治疗期间EBV DNA动态变化情况及预后判断等提供前期基础数据。

对象与方法

1 对象 选取2015年4月～2016年12月在本院肿瘤放疗科收治的57例初诊鼻咽癌患者，经鼻咽、颈部CT扫描或者MRI、胸片、腹部B超、电子鼻咽镜等检查手段，及进一步根据需要进行骨扫描或病理检查等明确TNM分期（2008分期方案）[4]及转移情况。其中男性43例，女性14例。年龄分布：最小17岁，最大80岁，平均年龄46.38岁。

2 仪器与试剂 仪器为美国ABI PCR扩增分析仪（型号7500），试剂为中山达安公司生产的“EB病毒核酸扩增PCR检测试剂盒”。荧光探针序列为：5'（FAM）-CCTCGGACAGCTCCTAAGAAGGCACC-3'引物序列为：F5'-AA-GCCCAACACTCCACCAC-3'，5'-CTGGTAGGACTGGGCGAC-3'。

3 方法

3.1 标本制备：用一次性无菌真空采血管（EDTA抗凝）抽取静脉血2 ml，轻轻混匀。取血浆50 μl置于灭菌的离心管中，加入等体积的DNA提取液，100℃裂解10 min，12 000 r/min离心10 min，取含DNA的上清液备用。

3.2 荧光定量PCR检测：PCR反应管中按顺序加入标本，阴阳性质控品，标准品各5 μl DNA 模板提取液，置于ABI7500PCR仪扩增检测，依据试剂说明书设置扩增条件及结果判断。

4 统计学处理：利用SPSS17.0软件分析初诊患者血浆EBV DNA阳性率及浓度水平在不同性别及年龄段的差异；同时对各病例TNM分期间的EBV DNA水平的差异进行单因素方差分析；按照公认的T、N、M分期进一步进行数据统计分析，采用卡方检验或t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 初诊鼻咽癌患者EB病毒阳性检出率与性别的关系 研究发现，57例鼻咽癌初诊患者EB病毒感染患者的阳性检出率为82.46%（47/57），以男性患者阳性检出率81.40%略低于女性患者（85.74%），差异无统计学意义见表1。

表1 不同性别患者的EB病毒检出率比较

2 不同年龄段患者的EB病毒阳性检出率见表2，不同年龄段EB病毒阳性检出率的差异无统计学意义。

3 与临床TNM分期的关系 57例鼻咽癌初诊患者按照TNM分期，其分布、检出情况及EBV DNA定量检测值见表3。TNM分期中，Ⅲ和Ⅳ期患者血浆EBV DNA浓度的差异有统计学意义（P＜0.0 5），Ⅳ期阳性率（9 5.2 4%）高于Ⅲ期（79.41%），平均拷贝数Ⅳ期大于Ⅲ期。T分期中，各期阳性率依次递增，平均拷贝数T1期＜T2期＜T3期＜T4期，T2和T4期EBV DNA浓度的差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 鼻咽癌初诊患者各年龄段与EBV感染检测出情况

表3 不同分期患者的血浆EBV DNA检出情况

讨 论

近年来大量文献报道了NPC患者血浆中EBV DNA水平与鼻咽癌的关系，病毒检出率与患者性别、年龄等基础参数的关系也是研究关注的重点之一[5]，有研究表明NPC的高危人群中有91.70%的个体可以检测到EBV DNA[6]，本研究利用实时荧光定量PCR方法检测57例初诊NPC患者血浆内EBV DNA浓度水平，EBV阳性检出率为82.46%，与其他省份的最新报道相近[7]。有文献报道初诊NPC患者的EBV感染情况与性别无相关性[8]，本研究结果亦显示不同性别阳性检出率的差异无统计学意义。

有学者通过测序比较了NPC患者血浆和原发肿瘤的EBV基因型，证实血浆EBV DNA是源于整合EBV的NPC癌细胞[9]，推测血浆内EBV DNA源于含有EB病毒的肿瘤细胞或者单核/吞噬细胞破裂后释放入血所致，故能很好的反应体内肿瘤的负荷情况。研究结果表明临床分期越晚，鼻咽癌患者血浆EBV DNA浓度水平和阳性率越高[10]。在本次研究中临床分期Ⅳ期鼻咽癌患者的EB病毒阳性率为95.24%，平均病毒含量为7 295.71拷贝数/ml，均高于Ⅲ期EB病毒阳性率（79.41%）和平均病毒含量（4 441.60拷贝数/ml）；T分期中各期患者的EB病毒阳性率和平均病毒含量依次递增，即

T1＜T2＜T3＜T4，其中T2和T4期血浆EBV DNA浓度的差异有统计学意义（P＜0.05）。N和M分期中EB病毒阳性率和平均病毒含量的差异无统计学意义，这可能也验证了一些观点：N分期系统仍存在问题，转移淋巴结大小与预后的关系一直存有争议，有学者认为颈部淋巴结的大小不是鼻咽癌的独立预后因素[11]。本次研究表明N1～N3各期的平均病毒含量要高于N0期，与冯海燕等研究结论一致[12]。由于M1期的病例数仅为2例，所获临床分期数据没有统计学意义，在随后的研究中会增加这部分病例的收集。总之，本研究结果也符合EBV DNA的水平2008TNM分期方案[13]。

许多研究表明，EBV DNA 浓度检测可作为NPC筛查及早期诊断指标，病毒表达水平对于NPC 患者的分期、预后判断等有重要意义[14]，血浆EBV DNA 浓度检测可作为评估鼻咽癌患者临床分期的一种辅助性检测指标，有望将其引入鼻咽癌分期系统中[15]。也有学者分析了鼻咽癌患者鼻咽部分泌物的EB病毒感染情况，认为鼻咽部分泌物的取材更加直接的反应局部病变[16]，还有文献表明鼻咽组织EBV检测的阳性率高于外周血[17]，本研究结果证明血浆EBV DNA检测作为非创伤性的检测方法值得在临床推广和应用，实验室应加强质量控制工作，以确保检测结果的精密度和准确度。

综上所述，EBV感染和NPC的发生、发展有密切关系，初诊NPC患者的EBV DNA浓度水平和肿瘤负荷情况密切相关，与中国2008TNM分期呈正相关，荧光定量PCR方法检测初诊NPC外周血内EBV DNA水平有助于临床分期诊断，这种非侵入性的外周血检测方法可作为NPC诊断与治疗的重要辅助诊断手段。

1 MUTIRANGURA A，PPRNTHANAKASEM W，THEAMBOONLERS A，et a1．Epstein-barr viral DNA in serum of patients with nasopharyngeal carcinoma [J]Clin Cancer Res，1998，4（3） ：665-669．

2 Liu MT，Yeh CY．Prognostic value 0f anti-Epstein-Barr virus antibodies in nasopharyngeal carcinoma（NPC）[J]．Radiat Med，1998，16（2）：113-117.

3 邓洪，曾毅，梁建甲．488 683人鼻咽癌普查基本方案分析[J]．肿瘤，2005，25（2） ：152-154．

4 中国鼻咽癌临床分期工作委员会.鼻咽癌92分期修订工作报告[J].中华放射学肿瘤杂志，2009，18（1）：2-6.

5 李冰，司勇锋，覃扬达，等.应用FQ-PCR技术测定鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA定量分析及其临床意义实用癌症杂志[J].2017，32 （2） ：200-203.

6 李志勇，杨荃荃，吉爽，等．EBV-DNA定量检测在鼻咽癌随访中的意义[J] .国际病毒学杂志，2015，22（4）：281-285．

7 张凤久 顾建华 宋柏龙，等. EB病毒检测对鼻咽癌诊断的临床意义[J] .国际病毒学杂志，2015，22（6）：408-410．

8 陈文学，邹学森，李金高，等.血浆EB病毒DNA检测对鼻咽癌诊断的价值研究[J].实用癌症杂志，2014，29（12）：1526-1528

9 L I N J C，W A N G W Y，C H E N K Y.e t a l.Quantification of plasma Epstein-barr virus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma [J].N Engl J Med，2004，350（24）：2461–2470.

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11 毛燕萍，李文斐，陈磊，等. 鼻咽癌2008 分期的临床验证 [J]《癌症》Chinese Journal of Cancer，2009，28（10）：1022–1028.

12 冯海燕，莫颖禧，周晓莹，等. 鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA水平与肿瘤的分期关系[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，22（6）：277-278.

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Objective To investigate the correlation between plasma EBV-DNA level and clinical stage of untreated nasopharyngeal carcinoma （UNPC）. Methods Clinical stage of the UNPC patients was determined by tumor node metastasis （TNM），and the content of EBV DNA in 57 UNPC patients was detected by fluorescence quantitative PCR. Result EBV-DNA positive rate was not correlated with gender and age of patients，but plasma EBVDNA concentration of stage Ⅲ patients was higher than stage Ⅳ patients （P＜0.05）. EBV-DNA positive rate of patients was increased with the development of T stage progress. The EBV-DNA concentration of stage T4patients was higher than stage T2patients （P＜0.05）. No significant difference of plasma EBV-DNA concentration between the stage M and stage N patients. Conclusion The level of plasma EBV-DNA concentration is positively correlated with clinical stages of nasopharyngeal carcinoma. Detection of plasma EBV-DNA by fluorescence quantitative PCR is a useful auxiliary method for UNPC diagnosis.

Real-time PCR Nasopharyngeal carcinoma Epstein-barr virus EBV

R392.11 R739.6

A

1671-2587（2017）05-0462-04

Application of EBV-DNA Detection to Staging of Untreated Nasopharyngeal Carcinoma FAN Ren-zhi，Laboratory Center of Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei，230001

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.016

230001 安徽省医科大学附属安徽省立医院

凡任芝（1978–），男，安徽淮北人，主管技师，硕士，主要从事临床检验诊断学质量管理控制，（E-mail）798114@163.com。

2017-04-02）

（本文编辑：潘健）