肺炎克雷伯菌形成生物膜菌株的基因型检测及其耐药探析*

彭蓉蓉 孔晓明 周翔

肺炎克雷伯菌形成生物膜菌株的基因型检测及其耐药探析*

彭蓉蓉 孔晓明 周翔

目的 探究肺炎克雷伯菌在医院中的分布状况及耐药性，并且分析生物膜阳性肺炎克雷伯菌的基因型，为临床合理用药提供依据。方法 选择本院2013年8月～2015年8月临床送检的感染性标本进行培养分离，检出160株肺炎克雷伯菌，分析该菌在医院的分布情况、耐药性及其基因型。 结果 所有肺炎克雷伯菌标本中呼吸道标本及尿液标本所占比重最大，分别占59.38%和22.88%；重症监护病房检出数所占比重最高（40.63%），其次为呼吸内科的16.25%及神经内科的14.38%。肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率占首位，为80.00%；其次为头孢唑啉（67.50%）；第三为头孢曲松（65.00%）。氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明和头孢噻肟（三代）的耐药率在50%以上。耐药率最低者为厄他培南，其次为亚胺培南。所有160株肺炎克雷伯菌中生物膜阳性比例为37.50%。检出ESBLs的16株生物膜肺炎克雷伯菌中，扩增出TEM基因和SHV基因所占比例分别为41.75%和31.25%，同时存在SHV及TEM基因所占比例为12.50%，但均未检测出CTX2M。结论 重症监护病房发生肺炎克雷伯菌感染的比重较高，细菌耐药性相对较低，而SHV及TEM为产生生物膜肺炎克雷伯菌的主要基因分型。

肺炎克雷伯菌 生物膜 基因型 耐药性

肺炎克雷伯菌是肠杆菌克雷伯氏菌属中的重要菌类，主要寄生在人体的上呼吸道和肠道，且作为条件致病菌能够导致机体免疫力低下者发生肺炎、菌血症等感染性疾病[1]。有研究表明[2]，肠杆菌科细菌在所有分离菌株中占有较高比率，而克雷伯菌属在其中所占比重为第二。生物膜作为有协调性、组织性的高度组织群体，相较于浮游菌对环境的适应能力更强，原因主要与生物膜中胞外多糖具有屏障作用，且内部细菌生长速度较慢等因素相关。生物膜对抗生素的抵抗力较强，常规药物难以有效渗透，因此临床对生物膜相关感染的有效治疗是一大难题[3]。不仅如此，产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）也是导致生物膜产生较强耐药性的关键因素，其基因型主要为SHV、CTX-M以及TEM型[4，5]。目前对产生物膜的肺炎克雷伯菌的主要基因型研究尚不多见，为此本研究主要分析生物膜阳性肺炎克雷伯菌的基因型，及其在医院中的分布状况及耐药性，为临床合理用药提供依据。

资料与方法

1 一般资料 选择本院2013年8月～2015年8月临床送检的肺炎克雷伯菌标本160株。

2 细菌培养鉴定与药敏实验 采用上海复星佰珞BIOFOSUN细菌鉴定仪，使用GN阴性菌鉴定板条鉴定菌株；药敏实验采用肠杆菌药敏板ME2 AST。以大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作为质控菌株，由南京便诊生物科技有限公司提供。

3 检测ESBLs方法 初步筛选实验使用K-B药敏纸片法，纸片选择头孢他啶、氨曲南及头孢噻肟，均为30μg/片。若头孢他啶的抑菌圈直径在22 mm及以下，头孢噻肟、氨曲南的抑菌圈直径在27 mm及以下，则为可疑产ESBLs株。再次测定菌株对头孢他啶（30μg/片）和头孢他啶（30μg/片）/克拉维酸（10μg/片），头孢噻肟（30μg/片）与头孢噻肟（30μg/片）/克拉维酸（10μg/片）的抑菌环直径，若两种药物中任一种加克拉维酸与不加克拉维酸的抑菌圈直径之差≥5 mm，即为ESBLs株。大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603做质控的阴性、阳性对照，由上海复祥生物科技有限公司提供。

4 基因分型 将已产生生物膜的肺炎克雷伯菌悬浮于TE缓冲液中，再使用煮沸法提取DNA行PCR扩增。SHV、TEM及CTX2M的基因分型情况见表1[6]。PCR反应方法如下：94℃预变性2 min；再94℃变性1 min，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；再72℃延伸 5 min，最后将扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳分析。SHV、TEM基因扩增能够产生471 bp、861 bp的PCR产物。

5 生物膜染色方法 采用半定量结晶紫染色法对所有分离肺炎克雷伯菌与生物膜阴性菌株染色，在595 nm单波长下检测吸光度。空白孔凋零，Ac表示生物膜阴性株吸光度，当试验株吸光度＞As时，则确定为生物膜阳性。最后选出生物膜为阳性的菌株。

表1 基因分型情况

结 果

1 肺炎克雷伯菌标本类型的分布 所有肺炎克雷伯菌标本中呼吸道标本及尿液标本所占比重最大，分别占59.38%和22.88%。见表2。

2 肺炎克雷伯菌标本医院分布情况 肺炎克雷伯菌标本在重症监护病房检出比重最高，为40.63%（65/160）；其次为呼吸内科及神经内科。见表3。

3 肺炎克雷伯菌的耐药性情况 肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率占首位，为80.00%（128/160），其次为头孢唑啉、头孢曲松，氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明和头孢噻肟（三代）的耐药率也在的比重最高，可能有如下几点：①重症监护病房内均为危重症患者，所需治疗时间较长，且使用药物剂量大，种类多；②重症监护病房内的患者通常需要接受呼吸机、静脉导管及导尿管等多种50%以上。耐药率最低者为厄他培南。见表4。

表2 肺炎克雷伯菌标本类型分布情况

表3 肺炎克雷伯菌标本医院分布情况

4 生物膜肺炎克雷伯菌所占比例及ESBLs基因分型 160株肺炎克雷伯菌中，有60株为生物膜阳性（37.50%）。检出ESBLs的16株生物膜肺炎克雷伯菌经PCR基因扩增，结果显示扩增出TEM基因7株（41.75%），扩增出SHV基因5株（31.25%），同时存在SHV及TEM基因2株（12.50%），未检出CTX2M。

讨 论

本研究中肺炎克雷伯菌主要以呼吸道标本为主，占59.38%。原因与肺炎克雷伯菌主要寄生于人体呼吸道相关[7]。分析我院肺炎克雷伯菌医院分布情况，以重症监护病房发生肺炎克雷伯菌感染侵入性操作，因此导致肺炎克雷伯菌感染率显著上升，且从另一方面表明侵入操作会显著增加医院感染的发生率；③重症监护病房患者通常需要长时间卧床休养，缺少锻炼，且自身机体免疫力低下，所以发生肺炎克雷伯菌感染的概率较高[8，9]。而呼吸内科发生肺炎克雷伯菌感染的比例占第2位，原因与患者机体抵抗力显著降低相关[10，11]。

表4 肺炎克雷伯菌耐药性情况

我院分离出的肺炎克雷伯菌耐药性较严重，但部分药物的耐药率相比于程君[9]等研究较低。本研究结果显示氨苄西林的耐药率最高，为80.00%，其次为头孢唑啉和头孢曲松，氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明和头孢噻肟（三代）的耐药率也在50%以上。此结果与其他医院情况相类似。耐药率最低者为厄他培南（0），其次为亚胺培南（1.25%）。

相关研究表明，肺炎克雷伯菌形成生物膜的概率较高，而生物膜也是导致肺炎克雷伯菌产生耐药性的重要因素[12]。本研究中，160株肺炎克雷伯菌中有60株为生物膜阳性，当生物膜产生后，在胞外黏多糖及调控细菌耐药基因表达等作用下，肺炎克雷伯菌对抗生素形成耐药[13，14]。对产生ESBLs肺炎克雷伯菌的基因分型，结果显示主要为SHV及TEM基因，未检测出CTX2M，原因可能与样本较少有关[15]。本研究中尚未分析生物膜肺炎克雷伯基因型及其耐药性的相关性，有待进一步研究。

综上所述，我院重症监护病房发生肺炎克雷伯菌感染的比重较高，而细菌耐药性相对较低，而SHV及TEM为产生生物膜肺炎克雷伯菌的主要基因分型。

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Objective To study the distribution and drug resistance ofKlebsiellapneumoniae in hospital and analyze the genotypes of K.pneumoniaewith biofilm.Methods One hundred and sixty strains of clinical specimens were collectedfrom August 2013 to August 2015.The bacterial distribution，drug resistance and K.pneumoniae genotype were analyzed.Results K.pneumoniaedominated in the specimensfrom respiratory tract and urethra，accounting for 59.38% and 22.88%，respectively.The highest rate of ICSI was 40.63%，followed by 16.25% and 14.38%.K.pneumoniaeresistance to ampicillin accounted for 80.00%，followed by cefazolin（67.50%），and ceftriaxone，（65.00%）.More than 50% of the strains tested showed relatively resistant to ampicillin/sulbactam，sulfamethoxazole and cefotaxime.Antibiotics to which K.pneumoniaeproduced less resistance included erpicane，followed by imipenem and cefotetan.The biofilm positive rate in all 160 strains was 37.50%.The ESBLs detected 16 strains of K.pneumoniae biofilm，41.75% of the bacteria presented positive TEM gene and 31.25%，SHV gene while bacteria carrying both SHV and TEM genes accounted for 12.50%.No CTX2Mwas detected.Conclusion The incidence of K.pneumoniae infection in intensive care unit is relatively high，and the drug resistance of the bacteria seems to be low.The predominant genotypes of K.pneumonia with biofilm include SHVand TEM.

Klebsiellapneumonia Biofilm Genotype Drug resistance

R378 R969.3

A

1671-2587（2017）05-0456-04Genotyping and Drug Resistance of Biofilm Formin g Strains of Kleb siella Pneumoniae PENG Rong-rong，KONG Xiao-ming，ZHOU Xiang.Department of Laboratory Diagnostics，People's Hospital of Liyang，Jiangsu 213300

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.014

*本课题受江苏大学医学临床科技发展基金项目（No.JLY20140095）；溧阳市重点研发计划（社会发展）项目（No.LC2015010）资助

213300 江苏省溧阳市人民医院检验科

彭蓉蓉（1983–），女，江苏溧阳人，主管技师，学士，主要从事检验医学工作，（E-mail）weqifyf@163.com。

2017-02-26）

（本文编辑：王虹）