一种八角炭疽病新病原鉴定

廖旺姣，邹东霞，黄乃秀，吴耀军，覃世杰，蒋晓萍

(1.广西壮族自治区林业科学研究院/广西特色经济林培育与利用重点实验室，广西 南宁 530002；2.广西国有六万林场，广西 玉林 537000)

一种八角炭疽病新病原鉴定

廖旺姣1，邹东霞1，黄乃秀1，吴耀军1，覃世杰2，蒋晓萍2

(1.广西壮族自治区林业科学研究院/广西特色经济林培育与利用重点实验室，广西 南宁 530002；2.广西国有六万林场，广西 玉林 537000)

【目的】通过研究八角炭疽病病原菌，为防治八角炭疽病提供病原学基础。【方法】对采自广西玉林、崇左、河池、百色、防城港等市八角炭疽病样本，进行单孢分离，致病性测定，采用形态学特征结合病原菌核糖体内转录间隔区(ITS)、微管蛋白(TUB2)、肌动蛋白(ACT)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPDH)多基因分子系统学的方法对分离菌株进行鉴定。【结果】菌株在PDA培养基25 ℃暗培养7 d后，菌落呈圆形，灰白色至灰黑色，分生孢子无色单细胞，圆柱状，顶端钝圆，基部平截，光滑，大小为(17.09±1.11)μm×(5.26±0.55)μm，分生孢子附着孢近椭圆形，浅褐色，边缘光滑完整，大小为(7.72±0.77)μm×(5.45±0.68)μm；病原菌ITS 、TUB2、ACT和GPDH四基因联合系统发育树显示，供试菌株与包括模式菌株在内的哈锐炭疽菌(ColletotrichumhoriiWeir&Johnst)聚在同一进化分支上。【结论】确定八角炭疽病病原菌为哈锐炭疽菌(Colletotrichumhorii)，其为八角炭疽病一种新的病原。

八角；炭疽病；哈锐炭疽菌；病原菌鉴定

【研究意义】八角(Illiciumverum)别名八角茴香、大茴香、大料等,是我国南方历史悠久的珍贵经济林树种之一, 主要分布在广西、云南、广东、福建、贵州等少数几个省区。八角树经济价值高, 是重要的香料、调味料, 可入药，也是化工主要原料之一[1-2]。据统计，目前广西栽培面积约26×104hm2, 产量和面积均占全国90 % 以上。炭疽病是危害八角叶片的重要病害，能引起大量落叶、造成大规模叶片提早脱落，严重影响八角产量及品质。近年来，由于八角纯林面积不断扩大及经营管理粗放，炭疽病发生面积及严重度呈上升趋势，采用原有的防治方法已经不能有效的防治病害。因此，对八角炭疽病病原重新进行研究，对八角炭疽病精准防治技术研究具有重要意义。【前人研究进展】据报道，2003年广西八角炭疽病危害非常严重，为有效防控该病害，吴耀军等[1]开展了相关的研究，鉴定出八角炭疽病病原菌为球炭疽菌Colletotrichumcoccodes(Wall) Hughes。黄思良等[2]对球炭疽菌生物学特性进行了研究。黄乃秀等[3]和廖明等[4]对球炭疽菌进行室内毒力测定。为防控八角炭疽病提供有效参考依据，实际运用有效降低八角炭疽病发生率，提高八角的产量和质量。【本研究切入点】结合本研究团队前期主要依据形态学特征鉴定八角炭疽病病原[1]工作的基础上，首次采用多基因分子系统学分析法对八角炭疽病菌进行遗传本质分析，再结合形态特征明确其种类。【拟解决的关键问题】对采集的八角炭疽病供试菌株，选择核糖体内转录间隔区(ITS)、微管蛋白(TUB2)、肌动蛋白(ACT)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPDH)等多基因中哪几个基因构建系统发育树，进行分子系统学分析，结合形态特征对供试菌株进行鉴定，明确八角炭疽病病原菌分类地位[5]。

1 材料与方法

1.1 病害样本采集

2015年从广西玉林、崇左、河池、百色、防城港等市采集八角炭疽病样本各1份。

1.2 炭疽菌的分离及致病性测定

参考方中达[6]的方法采用单孢分离法对病原菌进行分离，分离菌株在马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA)斜面培养5～7 d。将其斜面培养物置于4 ℃冰箱中保存备用。选择菌丝生长迅速、茂密，产孢量大的编号为GXYL1、GXCZ1、GXHC1、GXBS1、和GXFC1为供试菌株，菌株致病性测定参考吴耀军等[1]的方法。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 形态特征观察 将分离纯化的菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基25 ℃暗培养, 逐日观察, 记录病原菌的培养性状, 培养10 d, 挑取子实体镜检、观察, 拍摄并测量病菌的形态及分生孢子大小[7-10]。分生孢子附着孢诱导参照杨友联[8]的方法。

1.3.2 基因序列的测定及多基因系统分析 病原菌DNA提取、基因选择及目的片段扩增与测序参考朱英芝等[9]的方法、反应体系及条件。PCR产物送至上海立菲生物技术公司广州测序部测序。病原菌多基因系统发育树构建参考朱英芝等[9]的方法。

2 结果与分析

2.1 发病症状

主要危害叶片。叶片感病初期，出现水渍状、褐色小病斑，后扩展成圆形或不规则形水渍状大斑，后期病斑中部变为灰白色，密生许多小黑点，即病原菌分生孢子盘(图1-A)。病害发生严重时，引起大量叶片提前脱落。

A 八角炭疽病发病症状；B 接种发病症状；C分生孢子；D 分生孢子附着孢A: Symptoms of leaf anthracnose; B: Symptoms of inoculation; C: Conidia from culture; D: Conidial appressoria图1 八角炭疽病Fig.1 Illicium verum Anthracnose

The tree is rooted with C.cliviae(strains: CORCG2 and CORCX9)图2 基于ITS、TUB2、ACT 和 GPDH基因序列构建的炭疽菌系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree inferred from combined partial ITS, TUB2, ACT and GPDH sequences data of Colletotrichum

2.2 病原菌分离与致病性测定

从上述5个市采集的八角炭疽病害样进行分离培养，获得90株炭疽菌，菌落形态特征基本一致。选择代表菌株进行致病性测定，接种2 d后接种点开始变褐色，逐渐形成暗绿色水渍状圆斑，而后逐渐变成淡褐色，病斑逐渐扩大成圆形或不规则形，后期病斑中央呈灰白色，产生黑色小颗粒，发病症状与自然感病症状相似(图1-B)。依据柯赫氏法则，对接种发病后的坏死部位再次进行病菌的分离，均能获得与原分离菌株形态一致的病原菌，确定五个供试菌株均为八角炭疽病的致病菌[6]。

2.3 病原菌形态特征

在PDA培养基上，供试菌株菌落呈灰白色至灰黑色，绒毛状，边缘整齐，气生菌丝发达，未见菌核及刚毛。菌落生长速率为11.66～13.89 mm/d [mean±SD =(12.43±0.84)mm/d,n=6]。培养后期产生桔红色分生孢子堆，分生孢子为无色单细胞，圆柱状，光滑，顶端钝圆，基部平截，具有1～2个油球，大小为(17.09±1.11)μm×(5.26±0.55)μm (mean±SD ，n=100) (图1-C)。分生抱子附着孢近椭圆形，浅褐色，边缘完整，大小为(7.72±0.77)μm×(5.45±0.68)μm (mean±SD，n=20) (图1-D)。形态特征符合炭疽菌属真菌，因此，确定供试菌株为Colletotrichumspp.[7-10]。

2.4 多基因序列分析

将菌株GXYL1、GXCZ1、GXHC1、GXBS1和GXFC1的ITS、TUB2、ACT和GPDH基因序列与GenBank数据库进行比对，下载相关序列，构建上述4个基因联合系统发育树，结果显示，22个菌株共形成8个明显分支，相同种类炭疽菌均聚在同一分支，各分支之间都具有较高的支持率。5株供试菌株与哈锐炭疽菌C.horii模式菌株(ICMP 10492)聚在一起，进化距离最近，与球炭疽菌C.coccodes等其它炭疽菌形成明显分支(图2)。因此，多基因系统学分析结果确定八角炭疽病病原为哈锐炭疽菌C.horii。

3 讨 论

本研究将从八角分离到的炭疽菌鉴定为哈锐炭疽菌C.horii。这是首次在八角上发现由该菌引起的病害，与吴耀军等[1]报道的球炭疽菌C.coccodes不相同。2种病原菌感病症状相似，分生孢子形状相近。2种病原菌分生孢子均为圆柱状，顶端钝圆，基部平截。，哈锐炭疽菌分生孢子大小平均值为17.09 μm×5.26 μm，球炭疽菌则为17.00 μm×5.98 μm[1]，两者大小非常相近，从形态上比较难区分两种病原菌。引入多基因联合分析能有效地提高炭疽菌的准确识别率[5]，因此，本研究采用ITS、TUB2、ACT和GPDH多基因序列进行联合分析，明确本试验分离获得病原是哈锐炭疽菌C.horii，有效区分球炭疽菌C.coccodes。

哈锐炭疽菌C.horii最早在柿树(DiospyroskakiThunb)上有报道[10]，最初命名为柿盘长孢菌GloeosporiumkakiHori[11-12]，胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides[13]，基于分子生物学和形态学的差异，Weir[14]将柿树炭疽病菌的表位型重新界定为柿盘长孢菌G.kakiHori，分类学上将其归类为哈锐炭疽菌C.horii，是C.gloeosporioidessensu lato复合种的成员之一[15]。至此，张敬泽等报道的浙江无核柿炭疽病菌重新定义为C.horii[13]。此外，山东的次郎甜柿炭疽病菌亦为C.horii[15]。本研究从八角炭疽病分离获得的五个菌株多基因序列与柿树炭疽病菌C.horii(菌株ICPM 10492和C1069.2)聚在同一分支上，说明2种寄主上获得的病原相同。

4 结 论

本研究结果表明，对广西八角主产区玉林、崇左、河池、百色、防城港等市采集的炭疽病菌进行形态学结合多基因分子系统学分析法，明确上述各市获得八角炭疽病病原菌均为哈锐炭疽菌C.horii，这是广西八角炭疽病一种新病原。

[1]吴耀军，陆志华，黄乃秀，等. 八角炭疽病病原的研究[J]. 广西林业科学，2003，32(3)：118-120.

[2]黄思良，廖 明，岑贞陆，等. 八角炭疽病菌生物学特性的初步研究[J]. 中国森林病虫，2006，25(1)：1-4.

[3]黄乃秀，吴耀军，黄华艳，等. 八角炭疽病菌的室内药效试验[J]. 广西林业科学，2004， 33(4)：180-181.

[4]廖 明， 黄思良，岑贞陆，等. 八角炭疽病的化控试验[J]. 广西农业科学，2005，36(4)：365-368.

[5]杨友联, 刘永翔, 刘作易. 炭疽菌属真菌分类学研究进展[J].贵州农业科学, 2011, 39(1):152-157.

[6]方中达. 植病研究方法[M]. 北京: 中国农业出版社, 1998:122-143.

[7]陆家云. 植物病原真菌学[M]. 北京：中国农业出版社，2001: 454-459.

[8]杨友联. 中国贵州、云南、广西炭疽菌属真菌多基因分子系统学研究 [D]. 武汉:华中农业大学, 2010：1-110.

[9]朱英芝，廖旺姣，邹东霞，等. 广西油茶炭疽病病原菌鉴定及生物学特性[J]. 植物保护学报，2015，42(3)：382-389.

[10]Xie L, Zhang J Z Cai L, et al. Biology ofColletotrichumhorii, the causal agent of persimmon anthracnose [J]. Mycology, 2010, 1(4): 242-253.

[11]杜社妮,白岗栓,张树军,等. 柿炭疽病鉴别与防治[J].安徽农业科学,2010,38(13): 6805-6806.

[12]Hyde K D, Cai L, Cannon P F, et al.Colletotrichum-names in current use [J]. Fungal Diversity, 2009, 39: 147-182.

[13]张敬泽, 徐 同, 何黎平. 浙江无核柿炭疽病菌鉴定及附着胞形成过程中的核相变化[J]. 菌物学报, 2005, 23(4): 446-456.

[14]Weir B S, Johnston P R. Characterisation and neotypification ofGloeosporiumkakiHori asColletotrichumhoriinom nov [J]. Mycotaxon, 2010, 111: 209-219.

[15]余贤美， 侯长明， 王 洁，等. 次郞甜柿炭疽病菌的分离鉴定及其rDNA-ITS序列分析[J].经济林研究, 2014, 32(1): 45-50.

PathogenIdentificationofNewAnthracnoseofIlliciumverum

LIAO Wang-jiao1, ZOU Dong-xia1, HUANG Nai-xiu1, WU Yao-jun1, QIN Shi-jie2, JIANG Xiao-ping2

(1. Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Special Non-wood Forest Cultivation and Utilization, Guangxi Nanning 530002, China；2. Guangxi Liuwan State Forest Farm, Guangxi Yulin 537000, China)

【Objective】To provide the etialogical foundation for the control ofIlliciumverumanthracnose, the pathogen ofIlliciumverumanthracnose was identified. 【Method】The pathogens collected from Yulin, Chongzuo, Hechi, Baise and Fangchenggang city of Guangxi Zhuang Autonomous Region were isolated by unit-cell separation and incubation, tested for their pathogenicity, and identified through morphological studied and multi-gene phylogenetic analysis of ITS, TUB2, ACT and GPDH. 【Result】The strains on PDA were colorless at first, and then turned grey and grey-black after seven-days incubation at 25 ℃. Their conidia were colorless and single-celled, oblong, both blunt ends and averaged (17.09±1.11)μm×(5.26±0.55)μm. Conidial appressoria were ellipse, brown, smooth, complete and averaged (7.72±0.77)μm×(5.45±0.68)μm. Multiple-gene phylogenetic analyses indicated that these isolates were grouped in the same clade includingColletotrichumhoriiWeir&Johnst.【Conclusion】The strains were identified asC.horii. This is a new pathogen ofIlliciumverumAnthracnose.

Illiciumverum; Anthracnose;Colletotrichumhorii; Pathogen identification

1001-4829(2017)10-2242-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.014

2017-06-21

广西林业科技项目(桂林科字[2013]第15号)

廖旺姣(1980-)，女，广西灵川人，硕士，工程师，主要从事林木病害研究，E-mal: liaowangjiao@126.com。

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(责任编辑 陈 格)