典型烤烟品种腺毛形态及分泌特性比较分析

李艳华，张洪映，魏跃伟，崔红

河南农业大学，烟草学院，郑州市文化路95号 450002

典型烤烟品种腺毛形态及分泌特性比较分析

李艳华，张洪映，魏跃伟，崔红

河南农业大学，烟草学院，郑州市文化路95号 450002

为探讨烤烟叶面化学特征及其形成机制，本文以K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、豫烟11等代表性烤烟品种为试验材料，采用超景深显微技术、GC-MS分析检测技术和荧光定量PCR技术，对叶面腺毛形态、叶面化学成分以及腺毛分泌物合成关键基因表达进行了比较分析。结果发现：（1）烤烟腺毛由长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和非分泌保护毛等不同类型组成，翠碧1号和豫烟11中分泌型腺毛含量较高，而中烟100中非分泌型腺毛相对丰富。（2）西柏烷类化合物是烤烟叶面的主要化学成分，以K326中的含量为最高；赖百当类化合物在烤烟中含量极少，但豫烟11中顺冷杉醇和赖百当二醇含量较高。（3）西柏烷类合成酶关键基因CYC和CYP71D16在K326中表达活跃，赖百当合成酶关键基因CPS2在豫烟11中的表达量明显高于其它品种。不同烤烟品种之间叶面腺毛形态、基因表达及分泌物含量所存在的明显差异，可能与品种特色密切相关。

烤烟；腺毛；分泌物；二萜化合物；基因表达

烟草叶面化学（tobacco surface chemical）的概念由美国科学家Severson在1985年首次提出，明确了烟叶表面化学成分由二萜化合物、糖酯、蜡质、微量元素、挥发性化合物等组成[1]。其中，二萜化合物是叶面化学的主要组成成分，在叶面腺毛中特异性合成[2]，并与烟株抗性及香气品质密切相关[3]。

烤烟是支撑“中式卷烟”的核心原料。薛晓明等[4]对G28、K346、K326等10个烤烟品种进行了叶面显微观察，发现不同品种成熟期叶片叶面腺毛密度具有显著差异；吴云平等[5]对云烟85、K326、贵烟201和南江3号等叶面物质的检测分析发现，不同品种间叶面提取物总量和组分各不相同。而且，同一烤烟品种K326在不同的水分[6]、光照[7]、施肥[8-9]及生态环境[10]等条件下，其腺毛形态、结构以及分泌物积累也发生明显的改变，腺毛基因表达谱也因生态区的不同而表现出较大的差异[11]。以上研究表明，烤烟腺毛的发育及物质代谢受到遗传、栽培和环境条件的综合影响。目前研究缺乏我国重要烤烟品种叶面腺毛形态特征和分泌特性缺乏之间的比较，对腺毛物质代谢分子机制认识不清，使得针对叶面化学特性的遗传改良仍缺乏理论支撑。

本研究以广泛适用于我国主要植烟区的优良引进品种K326、适用于云、贵、川等清香型烟区的红花大金元、适用于黄、淮等浓香型产区的中烟100、福建烟区特色品种翠碧1号以及特香型品种豫烟11为材料，在相同栽培条件和生态环境下，对各品种叶面腺毛形态特征、叶面化学组分及含量、以及二萜化合物生物合成关键基因的表达水平进行了比较分析，旨在解析我国典型烤烟品种的叶面化学特性及形成机制，为烤烟叶面化学成分的定向和高效改良奠定基础。

1 材料方法

1.1 材料

K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号和豫烟11等5个烤烟品种包衣种子由河南农科院许昌研究所育种室提供。2015年3月漂浮育苗，5月6日移栽于河南农业大学许昌校区烟草试验基地，按照优质烤烟栽培规程进行种植和管理。

1.2 叶面腺毛形态观察

在烟株旺长期选取叶长约10 cm的顶叶，用0.2%（w/v）罗丹明B 水溶液染色60 min，将染色后的叶片在装有清水的4个烧杯中依次浸泡5 s，去除未结合的罗丹明B， 通风条件下自然晾干，在叶片中部沿主脉两侧1 cm处剪取6×8 mm组织块，叶面朝上置于VHX-5000超景深显微镜下（日本基恩士公司）进行叶片上表面腺毛的形态观察和腺毛密度统计。每个样本取3个叶片，每个叶片观察3个视野计数，并进行数据统计和分析。

1.3 叶面化学成分分析

在成熟期取中部叶（10～12叶位） 进行叶面分泌物的提取和测定。样品的制备及前处理参考韩锦峰等[12]的叶圆片法。每个品种选取5株长势一致的烟株，取成熟的中部叶沿中脉两侧截取直径为10 cm的叶圆片，每个烟株选取4片叶圆片，每个样本共计20个圆片，分别在二氯甲烷溶液中浸提。每个叶圆片浸提8次，每次2 s。在浸提液中加入内标（2.020 mg/mL的蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL的正十七烷醇的混合溶液）1 mL，混合均匀，旋转蒸发仪浓缩，硅烷化处理后，利用气相色谱质谱联用仪TRACE GC ULTRA–DSQⅡMS（美国赛默飞世尔科技公司）进行检测，仪器条件与王霄龙[13]所用相同。通过NIST12谱库检索定性，并结合Severson[14]的研究结果对二萜化合物进行鉴定，采用内标法定量（相对校正因子为1）。

1.4 RT-PCR分析

在烟株旺长期，取长约10 cm左右的顶叶进行RT-PCR分析。使用Total RNA puri fi cation kit（美国联川科技公司）进行叶片RNA提取，利用PrimerScript RT reagent Kit（日本宝生物公司）进行cDNA合成。使用 Premier Prime 5.0 软件，根据Genbank 发布的 CYC、CYP71D16、CPS2、ABS 和L25（作为内参基因）序列设计各基因扩增引物，如表1所示。利用LightCycler® 480 SYBR Green I Master ( 瑞士罗氏公司 )在 LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)上进行扩增反应。反应体系：2× LightCycler® 480 SYBR Green I Master，5 μl；10 μM Forward primer，0.2 μl；10μM Reverse primer，0.2 μl；cDNA，1 μl ；Nuclease-free H2O，3.6 μl。PCR 程序为：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 个循环。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每℃采集5次荧光信号。

表1 扩增引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 数据处理和统计方法

试验数据采用DPSv7.05版统计软件进行数据分析，由新复极差法分析均值差异的显著性, 显著性水平P ＜0.05，以a、b、c表示其差异性，显著性水平P ＜0.01，以A、B、C表示其差异性，数字后不含有相同字母表示差异有统计学意义；采用Excel 2007软件绘图制表。

2 研究结果

2.1 叶面腺毛形态分析

采用超景深显微镜技术进行各供试烤烟品种叶面腺毛的形态观察。由图1可以看出，烤烟腺毛属于混合型，各品种叶面腺毛均由长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛及保护毛三种类型组成：长柄分泌型腺毛由多细胞腺柄和1至多个细胞的腺头组成，短柄分泌型腺毛由一个柄细胞和四个顶生的腺头细胞组成，保护毛由多细胞组成，顶端成矛状，无腺头细胞。罗丹明与糖酯发生化学反应后形成玫瑰红色的复合物，根据颜色的深浅可进行糖酯含量的快速检测。图1显示，不同类型腺毛对罗丹明的染色反应各不相同。长柄分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛的腺头部位皆可被罗丹明染成红色，翠碧1号、豫烟11、K326着色较为明显，中烟100和红花大金元染色较浅。保护毛无显色反应，这可能与其缺乏腺头细胞有关。

图1 不同烤烟品种叶面腺毛形态观察Fig. 1 Observation of foliar trichome of different fl ue-cured tobacco varieties

对5个品种腺毛密度及各类型所占比例进行了统计分析（表2）。从腺毛总密度来看，豫烟11和翠碧1号最高，红大和K326较低。从不同腺毛类型来看，长柄分泌型腺毛在翠碧1号和豫烟11中含量依然较高，在K326、红花大金元和中烟100三个品种中含量相近；短柄分泌型腺毛在翠碧1号中密度最高，其次是豫烟11和K326；保护毛在中烟100中的密度明显高于其它4个品种。从同一品种来看，K326、翠碧1号、红花大金元3品种中，短柄分泌型腺毛所占比例较高， 豫烟11中长柄分泌型腺毛所占比例较高，而中烟100中保护毛占有绝对优势。

2.2 叶面化学成分分析

利用二氯甲烷对成熟中部叶进行叶面化学成分萃取，并进行GC/MS检测（表3）。可以看出，烤烟叶面分泌物主要包含二萜化合物、烷烃和糖酯3大类。其中，以二萜化合物含量较高，且品种间变化幅度较大。

对5个烤烟品种叶面二萜化合物的分析结果如图2。可以看出，烤烟中二萜化合物包含西柏烷化合物和赖百当化合物两大类。西柏烷类化合物含量较高，其中CBT-diol含量占有绝对优势，而CBT-ol含量相对较低。品种间相比较，K326西柏烷类化合物含量最高，其次为豫烟11、红花大金元，翠碧1号和中烟100中含量较低。赖百当化合物在烤烟中含量较低，主要包括 Cis-abienol和 Labdenediol。Cis-abienol虽在5个品种中都能被检测到，但在豫烟11中含量明显较高；Labdenediol却仅在豫烟11中有少量存在，在其它四个品种中均未被检测到。这表明与其它烤烟品种相比，豫烟11的二萜生物合成代谢具有明显特性。

表2 不同烤烟品种腺毛密度和比例分析Tab.2 Densities and percentages of trichomes of different fl ue-cured tobacco varieties

表3 不同烤烟品种叶面化学成分分析Tab.3 Leaf surface chemical analysis of different fl ue-cured tobacco varieties

图2 不同烤烟品种叶面二萜化合物检测分析Fig. 2 Diterpenoid analysis of different fl ue-cured tobacco varieties

2.3 二萜生物合成关键基因表达分析

采用荧光定量PCR技术对5个烤烟品种幼叶中二萜生物合成关键基因表达进行了比较分析（图3），可以看出，西柏烷生物合成的两个关键基因CYC（西柏三烯一醇合成酶基因）和CYP71D16（西柏三烯二醇合成酶基因）在各检测品种都有较高水平的表达，以K326的表达量为最高，中烟100和翠碧1号表达量较低。赖百当生物合成关键基因ABS（顺冷杉醇合成酶基因）在各品种中都表达，但其上游基因CPS2（卡巴基焦磷酸合成酶基因）仅在豫烟11中高表达，在其余4个品种中表达水平极低。这可能是导致赖百当化合物含量在大部分烤烟品种较低，而在豫烟11中较高的关键原因。

图3 不同烤烟品种二萜生物合成关键酶基因表达比较分析Fig. 3 Relative expression analysis of key genes related to diterpenoid biosynthesis of different fl ue-cured tobacco varieties

3 讨论与结论

植物腺毛按分泌特性可分为分泌型和非分泌型两大类。以拟南芥[15]为代表的非分泌型腺毛构成了植株与环境间的物理屏障，参与植物对逆境防御反应；薄荷[16]、青蒿[17]等分泌型腺毛具有次生代谢物质合成和分泌能力，具有可观的商业价值。烟草既有分泌型腺毛也有非分泌型腺毛，属于混合型。长柄分泌型腺毛是西柏烷二萜化合物合成和分泌的主要场所[18]，短柄分泌型腺毛是合成和分泌烟草叶面抗性蛋白（T-phylloplain）的主要部位[19]，而保护毛无腺头细胞，不具备分泌能力[15]。在供试的5个烤烟品种中，不同类型腺毛所占比例各不同。豫烟11中长柄分泌型腺毛所占比例较高，K326中短柄分泌型腺毛所占比例较高，而中烟100中保护毛所占比例较高。虽然，目前对烟草腺毛发生的分子机制还知之甚少[20]，但由此可以推测，不同烤烟品种中控制不同类型腺毛发生的基因在表达丰度上具有一定差异。

烟草腺毛密度随叶片发育时期、栽培措施及生态区域的不同而不同[3]。因而，在对不同烟草品种腺毛密度的比较研究中，选择合适的试验条件及取样方式尤为重要。杨铁钊等[21]曾提出，烟草腺毛密度随着叶片发育呈现大幅度的变化，在叶片发育成熟期趋于稳定，是进行腺毛密度研究的最适时期。以K326中部成熟叶片上表皮腺毛密度的相关研究为例：薛晓明等[4]在黑龙江对10个烤烟品种腺毛密度的比较研究中，K326腺毛密度为最低，仅2.33根/mm2；付玉兰等[22]在云南对四个品种腺毛密度的比较研究中，K326则较高，达5.28根/mm2；而同样是在云南，张亚婕[23]等报道K326成熟期中部叶上表皮腺毛密度高达10.07根/mm2。这说明叶片的成熟过程受到光、温、水、肥等多种因素的影响，以成熟叶片为材料进行品种之间腺毛密度的比较研究，将难以避免栽培及环境因素所带来的影响。鉴于此，本文以幼叶为材料进行不同品种腺毛密度的比较研究，以求最大限度地反映出品种的遗传特性。

腺毛密度是腺毛分泌物积累的基础条件。但在本研究中，翠碧1号长柄腺毛密度最高，其类西柏烷化合物含量却明显较低；而类西柏烷化合物含量最高的K326，其长柄腺毛密度也比较低。这表明幼叶期腺毛密度和成熟期叶面分泌物含量之间并无因果关系。李鹏飞等[24]曾报道，成熟叶片腺毛密度和叶面分泌物之间也非简单正相关。由此推测，腺毛分泌物含量是由腺毛密度和腺毛物质代谢强度所共同决定的。为此，我们进一步对不同品种幼叶的二萜代谢相关基因表达进行了检测分析。在腺毛密度较高的翠碧1号中，西柏烷化合物合成关键基因CYC和CYP71D16的表达量明显偏低；而腺毛密度较低的K326中，这两个基因的表达量保持在较高水平。该结果在转录水平证明，K326腺毛西柏烷化合物合成能力强于翠碧1号。这可能是导致K326叶面分泌物丰富的根本原因。

不同烤烟品种腺毛分泌物含量不同，其组分也存在较大差异。西柏三烯二醇是烤烟叶面化合物的主要成分，在不同品种中含量都较高。类赖百当化合物在烤烟品种中含量较低，赖百当二醇只在豫烟11中存在，顺冷杉醇在几个品种中都被检测到有微量存在，而豫烟11的含量明显较高。王冬等[25]对8306、12451、云烟87、豫烟11、中烟100等品种（系）的叶面化学成分进行了分析，也发现豫烟11及其亲本8306中西柏烷类化合物含量较高，但并未提到赖百当类化合物在其中的存在。为进一步验证该结果，我们对赖柏当生物合成关键基因的表达进行了分析。结果发现，虽然ABS基因在五个烤烟品种中都有不同程度的表达，但其上游基因CPS2，催化由GGPP向8-OH-CPP的转化，则只在豫烟11中有较高的表达，在其它几个烤烟品种中表达量极低。该结果不仅解析了豫烟11叶面化学特色形成的分子机制，也表明烤烟中赖百当化合物的缺失与CPS2基因表达受阻密切相关，这与Sallaud等[26]的观点相同。CPS2基因在赖百当生物合成中所起的关键作用预示了其在烟草香气分子改良中具有较大的应用潜力。

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：LI Yanhua, ZHANG Hongying, WEI Yuewei, et al. Comparison analysis of trichome morphology and secretion of typical fl uecured tobacco varieties[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(2)

*Corresponding author.Email：cuihonger_13@163.com

Comparison analysis of trichome morphology and secretion of typical fl ue-cured tobacco varieties

LI Yanhua, ZHANG Hongying, WEI Yuewei, CUI Hong*
College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

To characterize the formation mechanism of tobacco trichome exudates, five representative flue-cured tobacco cultivars were studied in trichome morphology, leaf surface chemical components, and expression patterns of genes related to trichome exudates biosynthesis using super depth of fi eld microscopy, GC-MS analysis, and real-time fl uorescent quantitative PCR techniques，respectively.Results indicated that (1) Two leaf trichome types of fl ue-cured tobacco were identi fi ed, including glandular trichomes and non-glandular trichomes. The proportion of each type was different in these tobacco cultivars with glandular trichomes being more abundant and dense in “Cuibi1” and “Yuyan11” compared to other cultivars, while non-glandular trichomes were most abundant in “Zhongyan 100”. (2) Cembranoids were main compounds in tobacco trichome exudates. Among these cultivars, cembranoids were most abundant in “K326”. As the main trichome exudates of oriental tobacco, labdanoids were rarely detected in these fl ue-cured tobacco cultivars except “Yuyan11”. (3) Expression pattern analysis showed that the expression level of cembranoid biosynthetic related genes (CYC and CYP71D16) was high in “K326”. Meanwhile, labdanoids biosynthetic related genes (CPS2 and ABS) expressed strongly in “Yuyan 11”. These results provided new perspectives for tobacco breeding and metabolic engineering of trichome exudates.Keywords： fl ue-cured tobacco; trichome; secretion; diterpenoid ; gene expression

李艳华，张洪映，魏跃伟，等. 典型烤烟品种腺毛形态及分泌特性比较分析[J]. 中国烟草学报，2017, 23（2）

中国烟草总公司基因组重大专项“烟草腺毛功能基因挖掘与分子调控研究”（110201401003 JY-03）

李艳华（1990—），硕士研究生，主要从事烟草生理生化研究，Tel: 0371-63558586，Email: lyhyhlyh@163.com

崔 红（1966—），教授，硕士研究生导师，主要从事烟草生物技术研究，Email:cuihonger_13@163.com

2015-09-18；< class="emphasis_bold">网络出版日期：

日期：2017-02-13