复合植物提取物的安全性及抗球虫作用的研究

孙 静 王 振 张荣飞

（1.天津纳尔生物科技有限公司，天津300457；2.北京五洲恒通认证有限公司，北京100068）

复合植物提取物的安全性及抗球虫作用的研究

孙 静1王 振2张荣飞1

（1.天津纳尔生物科技有限公司，天津300457；2.北京五洲恒通认证有限公司，北京100068）

鸡球虫病是一种危害大且难以防治的寄生虫病，该病可对养鸡业造成重大经济损失。本研究新型的复合植物提取物，通过细胞毒性试验，验证产品的安全性，然后根据最低有效浓度，设计体外试验，研究产品对艾美尔球虫病的抑制活性。结果显示，该产品可以在一定浓度下可以有效地抑制球虫病，且无细胞毒性。

植物提取物 细胞毒性 球虫病

艾美耳球虫和隐孢子虫的寄生虫无处不在，在原生动物以及在人类的免疫抑制人群，及其发展和传播的风险是持续的。

鸡球虫病由寄生在鸡肠上皮细胞内的艾美耳属多种球虫原虫引发[1]。作为严重危害养鸡业的全球流行性鸡病之一，该病的发生率较高，分布范围广，危害严重，其病死率可达35%～82%。全球因鸡球虫病造成的经济损失可以达到1亿～3亿元美元[2，5]，给禽类养殖造成严重的经济损失。长期以来，养殖业一直依赖于抗球虫药物，化学药物和抗生素类药物对鸡球虫有积极的治疗作用，但是也产生极大的耐药性[6，7]，而且这些药物造成了鸡肉和鸡蛋中的药物残留，给人类食品安全带来极大隐患，同时也不利于养殖业健康的发展[8]。

本实验室研制出一种蛋鸡用复合型植物提取物产品，体外试验研究显示了产品的安全性和良好的抗球虫效果。

1 T-Rova细胞安全性评价

1.1 材料和方法

1.1.1 试验材料

试验细胞系：本次试验选用了英国Rovamycine，100g/瓶，购自上海浩然生物技术有限公司，细胞被称为T-Rova。

1.1.2 主要试验用试剂

复合植物提取物，公司自有；MTT，Fluka公司；细胞培养液M EM，GIBCO公司；胎牛血清，北京生物制品研究所；台盼蓝染色剂等。

1.1.3 试验仪器

酶标仪，Tecan Infinite F50，瑞士帝肯；二氧化碳培养箱，ICW190/ICA175，德国IRM；96孔培养板，康宁3599，北京赛因坦科技有限公司；生物显微镜，Eclipse Ni-U，日本尼康等。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养液的制备

100μl普通培养基加入15%～20%的胎牛血清，制备成细胞培养液。

1.2.2 试验过程

在对照孔（T）中加入：100ul含有5000 TG180细胞培养液中加入100μl普通培养基（含15%～20%的胎牛血清）[9]。

试验组中加入：100ul含有5000 TG180细胞培养液中加入100μl产品，作连续倍比稀释

稀释浓度分别为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64。

1.2.3 台盼蓝染色法

将1×105细胞悬液接种于96孔细胞培养板（100ul/孔），将7组试验组和1组试验组放于37°二氧化碳培养箱中继续培养[10]。5%C O2+95%空气条件下培养四天后取出，通过生物显微镜观察，细胞生长状况，离心收集每四个孔板中的细胞，用台盼兰染色在显微镜下观察、计数，活细胞不容易被染色，平滑，圆整，分离的；死细胞是蓝色，无活力，呈海胆状。吸取少量经过染色的细胞，用血细胞计数板计数。计算活细胞率。

1.2.4 比色法

加入MTT液继续培养4h。吸除原液，加入DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为630 nm下测定吸光度值，根据公式计算细胞的相对增殖度（RG R）[11]。

1.3 结果分析

通过细胞计数法计算活细胞率，对比不同组的试验结果。

表1 球虫病在畜牧业中的分类

表2 T-Rova细胞毒性反应结果

通过试验结果可知，稀释到1/8浓度，该产品无细胞毒副作用，不影响细胞的正常生长和增殖。

2 抗球虫有效性试验

2.1 试验方法

本研究的有效性试验浓度由1/8开始。研究中有两个对照组，一个对照组不含有球虫，与其他含有球虫对比检验细胞是否生长正常[12]。

2.2 试验过程

对照组一（T1）无球虫加入：100μl含有5000 TG180培养基加入150μl普通培养基。

对照组二（T2）有球虫加入：100μl含有5000 TG180培养基加入100μl含有200艾美尔球虫再加入50ul普通培养基。

试验组中加入：100ul含有5000 TG180培养基加入100ul含有200艾美尔球虫再加入50μl此时产品浓度的5倍，最终稀释浓度为1/16、1/64、1/128。

将96孔板放置于37°二氧化碳培养箱中，5%C O2+95%空气混合条件下，培养4d。

2.3 结果分析

试验结果在低倍显微镜下观察得出，阴性结果表明生长状况不好，标记为（-），阳性试验结果表明生长状况良好，标记为（+），可以看到菌群迅速增殖，细胞破裂后又长出新的球虫细胞[13，14]。

图1 抗球虫有效性试验结果

反复进行生物学观察发现，在1/16浓度处有一个阳性对照，此外在1/16浓度处的细胞毒性结果表明此浓度下细胞可以缓慢生长[15]。1/32浓度下产品对所有孔板中的球虫起到抑制作用，说明该浓度下产品对球虫有良好的抑制作用。

3 讨论

在我国植物资源丰富，尤其是药用植物品类繁多，并且毒副作用小，无药物残留，不易产生耐药性。不同于化学药品只有单一的功能，本研究中利用天然植物薄荷、牛至等复合成新型的饲料添加剂产品，通过多种植物提取物互相促进、协同作用，可以有效地抑制球虫病。

细胞安全性试验结果表明：在≤1/8浓度下，添加产品的T-Rova细胞系可以正常生长和增殖，表明此浓度下不影响细胞正常的生长，无毒性反应。

抗球虫有效性试验结果表明：在1/16浓度下，产品具有的抑制球虫效果，在1/32浓度下，产品具有显著的抑制球虫效果，且此浓度下的细胞可以正常生产，无毒性反应。

综上所述，本研究中的复合植物提取物对球虫有良好的抑制效果[16，17]，且不影响细胞的正常生长，不破坏细胞性能。产品来源于植物提取物，安全性高[18]，有望开发成新型的抗球虫饲料添加剂产品。

[1]马海利，郑明学，李元平，等.中药抗柔嫩艾美尔球虫机制研究[J].中国预防兽医学报，2001，23（1）：33-35.

[2]汪明，孔繁瑶，殷佩云，等.10株柔嫩艾美耳球虫对四种药物的抗药性检测[J].中国农业大学学报，1996，1（5）：110-114.

[3]刘永举，郭世宁.中药对鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫的疗效观察[J].中兽医学杂志，2000，（1）：3-4.

[4]刘萍，周茂林，胡海，等.抗球虫中药制剂“鸡球康”对鸡球虫病的疗效实验[J].四川畜牧兽医，1998，12（1）：13-17.

[5]费陈忠，薛飞群，赵其平.中草药制剂T F-103抗鸡柔嫩艾美耳球虫病的临床试验[J].中兽医医药杂志，2004，（5）：48-50.

[6]李致宝.化学抗球虫中药和中草药对球虫病的疗效对比试验[J].畜禽业，2000，（8）：16-17.

[7]杜爱芳.中草药复方制剂对鸡柔嫩艾美耳球虫的疗效研究[J].中兽医医药杂志，2001，（3）：9-11.

[8]李蕴玉，李佩国，陈丽凤，等.地克珠利与中药联合应用对鸡球虫病的疗效试验[J].中国兽医科技，2002，32（4）：26-27.

[9]黄哲玮，孙皎，孟爱英.两种体外细胞毒性检测方法的比较研究[J].生物医学工程学进展，2005，26（4）：205-207.

[10]高梅，曹冲，马会，等.细胞毒性试验中两种细胞计数方法的比较[J].医学动物防治，2016，（12）：1313-1316.

[11]张茂贵.畜禽常用抗球虫药的使用和中毒诊断[J].现代畜牧科技，2017，（3）：68.

[12]周佰峰.鸡球虫病的诊断与防治技术[J].现代农业，2016，33（4）：98.

[13]Xu，Z.Y.，E.Fitz，N.Riediger，and M.H.Moghadasian.Dietary octacosanol reduces plasma triacylglycerol levels but not atherogenesis in apolipoprotein E-knockoutmice[J].Nutr.Res，2007，（27）：212.

[14]Gouni-Berthold，I.，and H.K.Berthold.Policosanol：clinical pharmacology and therapeutic significance of a new lipid-lowering agent[J].Am.Heart.J，2002，（143）：356-365.

[15]Singh，D.K.，L.Li，and T.D.Porter.Policosanol inhibits cholesterol synthesis in hepatoma cells by activation of AMP-kinase[J].Pharmacol.Exp.Ther，2006，（318）：1020-1026.

[16]Junk，S.M.，A.Dharmarajan，and J.L.Yovich.FSH priming improves oocytematuration，but priming with FSH or hCG has no effect on subsequent embryonic development in an in vitromaturation program[J].Theriogenology，2003，（59）：1741-1749.

[17]Schoevers，E.J.，A.Kidson，J.H.M.Verheijden，and M.M Bevers.Effect of follicle-stimulating hormone on nuclear and cytoplasmicmaturation of sow oocytes in vitro[J].Theriogenology，2003，（59）：2017-2028.

[18]Wang，H.B.，G.L.Xia，L.I.Mei-Ling.Effects of Recombinant Human Follicle-Stimulating Hormone and Epidermal Growth Factor on the Development of Oocyte-Granulosa Complexes of Immature Mice in vitro[J].Develop.Reprod.Bio，2001，（10）：21-30.

国家科技支撑计划 含有米糠活性物质的安全高效新型饲料添加剂的研究与应用（14ZCZDNC00006）

孙静，硕士，畜牧师，动物遗传育种与繁殖专业。