兴化地区小鹅瘟疫情的监测及实验室诊断

鲁 洋 吉春粉 顾 琪 史明基

（1.江苏省兴化市合陈畜牧兽医站，江苏兴化225700；2.江苏省兴化市畜牧兽医站，江苏兴化225700；3.兴化市动物卫生监督所，江苏兴化225700）

兴化地区小鹅瘟疫情的监测及实验室诊断

鲁 洋1吉春粉1顾 琪2史明基3

（1.江苏省兴化市合陈畜牧兽医站，江苏兴化225700；2.江苏省兴化市畜牧兽医站，江苏兴化225700；3.兴化市动物卫生监督所，江苏兴化225700）

对兴化地区从2007年4月至5月间小鹅瘟的流行情况进行了监测，在整个监测期内共收集到疑似小鹅瘟临床病例3个，对3个病例分别采集肝、脾、肾等病料组织，处理后接种12日龄发育鹅胚，所有接种胚均于72～84h内死亡，死亡胚的病变特征与小鹅瘟病毒致死鹅胚的特征相符。提取死亡胚尿囊液总DNA，根据文献报道的PCR方法进行检测，所有样品均可扩增出大小为2200bp的目的条带，与小鹅瘟弱毒疫苗SYG26-35株扩增结果一致，从而将3个临床病例确诊为小鹅瘟。

小鹅瘟 监测 实验室诊断

兴化市地处长江三角洲，水资源十分丰富。该地区的水禽养殖发展十分迅速，已形成一系列具有特色的产业结构。周边的相邻地区的水禽养殖发展也十分迅速，成为当地的农民增收的一大亮点。兴化市共有孵坊37家，其中孵化苗鹅的有26家，种蛋主要来自昆山、浙江以及兴化本地，苗鹅主要售往南通、扬州、昆山、连云港、安徽等地，本地也有一部分。2015年4月～2016年5月间，有孵坊反映苗鹅发生了大批量死亡，发生问题的孵坊有13家。发病情况基本一致，苗鹅在4～10日龄期间发生疫病，病程6d左右，发病率50%～80%，死亡率40%～70%。发病鹅表现为精神委顿，厌食，拉白色或淡黄绿色稀粪，喙端颜色发暗，临死前出现两腿麻痹。病死鹅剖检病变为肝脏略肿大，颜色较淡，空肠和回肠表现为卡他性肠炎。所有发病鹅群其种蛋来源均有一个共同特征，即母鹅免疫接种所用的疫苗均为吉林生物制品厂的疫苗（G D株），而同期使用扬州威克生物制品有限公司生产的小鹅瘟活疫苗（种鹅用）的母鹅所产的种蛋孵化出的雏鹅均未见发病。据孵坊反映在湖州、嘉兴也有类似情况发生。为了防止该病在2017年度再次发生，兴化市畜牧兽医站除对免疫用疫苗进行调整以外，还制定了针对该地区重点养殖户的疫情监测计划，本文的主要研究内容正是结合该监控计划，从该地区收集疑似小鹅瘟临床病例，并通过实验室手段进行确诊，以期为该地区的小鹅瘟的防控提供必需的疫情信息。

1 材料与方法

1.1 12日龄非免疫种鹅胚

选用未接种小鹅瘟疫苗的种鹅群所产的种蛋，自行孵化至12日龄。

1.2 PCR引物设计与合成

GPV特异性PCR引物按照文献[7]方法设计，针对的靶基因为VP1，可用于扩增全长V P1基因，预期扩增产物大小为2200bp。引物序列为：GPV-F：5'-GCAGATATGTCTACTTTTTTAG-3'；GPV-R：5'-AATTTACAGATTTTGAGT -3'。引物由上海生工生物工程服务有限公司合成，用灭菌超纯水稀释至25μmol/L，-20℃保存备用。

为了实现摆杆角度和小车位移的高精度控制，对倒立摆角度的控制同时要兼顾对小车位移的控制，假定系统的补偿输入是以小车位移为输入通过两个相同的改进型ESO的扰动作用之和来进行补偿，所设计的改进型ADRC结构如图2所示。

1.3 生化试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs购自大连宝生物工程有限公司；Wide Range DNA Marker（500～12000bp）购自大连宝生物工程有限公司；蛋白酶K购自MERCK公司；十二烷基磺酸钠（SDS）购自Sigma公司；其他常规试剂均为国产分析纯产品。

1.4 主要仪器

在整个小鹅瘟疫情高发季节（2016年4月～5月），总共发现3例疑似小鹅瘟病例（分别命名为样品1、样品2和样品3），且3批发病雏鹅均来源于同一孵坊。

1.5 疫病监测与样品采集和处理

取收获的鹅胚尿囊液500μl，加入蛋白酶K至终浓度为500μg/mL，加入SDS至终浓为1%，充分混匀后，置55℃水浴作用30min。然后分别用Tris饱和酚（pH8.0）、苯酚：氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，吸取水相，加1/10体积3mol/LNaAc（pH5.2）及2.5倍体积无水乙醇沉淀，置-20℃10min。12000 rpm离心15min，沉淀用70%乙醇洗涤，晾干后悬浮于30μl含RNaseA（20μg/mL）、无DNase的TE（pH8.0）中。同时提取小鹅瘟疫苗毒株SYG26-35含毒尿囊液和健康鹅胚尿囊液DNA分别作为阳性对照和阴性对照[7]。

1.6 病毒分离

PCR反应体系（50μl）为：

1.7 PCR检测

1.7.1 PCR模板DNA的制备

对所有临床发现的小鹅瘟疑似病例，均无菌采集发病鹅肝、脾、肾，用灭菌生理盐水按1：10比例匀浆，-20℃与37℃反复冻融3次，3000 r/min离心10min取上清，加入双抗溶液（含青、链霉素各10000μg/ml）进行除菌处理[6]。

1.7.2 PCR反应

将处理好的病料按0.3ml/胚的量接种13日龄鹅胚，37℃继续孵化，每日照胚3～4次，死亡鹅胚置4℃冰箱4h左右收缩血管，无菌收集尿囊液[5]。

超纯水 37.5µL10×Reaction buffer（with15mmol/L MgCl2） 5.0µLdNTPs（2.5mmol/L） 4.0µL引物GPV-F（25μmol/L） 0.5µL引物GPV-R（25μmol/L） 0.5µL DNA模板 2.0µL Taq DNA聚合酶 0.5µL

PCR反应参数为：95℃预变性2min；95℃变性1min→50℃退火1min→72℃延伸2.5min，共30次循环，最后72℃延伸10min，4℃保存[6]。

取PCR产物5μl，加6×上样缓冲液1μl混匀，1.2%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭0.5μg/ml）电泳，于0.5×T B E电泳缓冲液80 V电泳1h观察结果。

1.7.3 琼脂糖凝胶电泳

本文以南通蓝印花布的数字化纹样图像为研究对象，通过数码相机等设备为其进行数字化图像的采集。另外，针对蓝白两色的蓝印花布这一特点，对其数字化图像进行相关预处理，包括灰度化、中值滤波去噪和归一化等操作；经过大量实验后，确定采用加权值法与最大值法结合的灰度化处理来处理，其公式如下所示：

性状:较正品大,呈宽卵形,长5-6mm,宽5-8mm,表面淡黄白色,略光滑,一端圆阔,有一淡棕色点状种脐,另端稍窄。背面圆凸;腹面有一条较宽而深的纵沟。[13]

2 结果

2.1 小鹅瘟疫情监测结果

台式高速离心机（TGL-16型）为上海医用分析仪器厂产品；PCR仪（2400型）为美国Applied Biosystem 公司产品；BIORAD3000 XI型电泳仪为美国BIO-RAD公司产品；Millipore纯水仪Milli-Q（低热源型）为法国Millipore公司产品；20μl及200μlGilson移液器为法国Gilson 公司产品。

3.2 地草地螟、蚜虫防治：用20%杀灭菊酯乳油2000倍液～3000倍液，或2.5%敌杀死乳油倍液2500倍液～3000倍液，或2.5%功夫乳油2500倍液～3000倍液均匀喷雾。

2.2 病毒分离结果

病料接种后72-84h鹅胚死亡，死亡胚的病变特征为绒尿膜增厚，全身皮肤充血，翅尖、趾、胸部毛孔、颈、喙旁均有较严重出血点。

2.3 PCR试验结果

电泳结果显示S YG26-35疫苗毒和病料接种收获的尿囊液均可以扩增出预期大小的2200 b p的目的条带，而阴性对照未扩增出任何条带，结果如图1所示。

图1 PCR产物电泳结果M. Wide Range DNA Marker

3 讨论

小鹅瘟主要侵害的是4～20日龄的雏鹅，自然条件下成年鹅的感染是无症状的，但可经卵将病传给下一代，而且该病在鹅群中的发病主要集中于3周龄以内的雏鹅。根据这一特点，对留种母鹅进行免疫接种是防治该病最有效的办法，可以保证新生雏鹅在出壳后的一段时间内能够保持较高的母源抗体水平，帮助其度过最易感的年龄阶段。在这种情况之下，种鹅的免疫效果直接决定了雏鹅群中该病的防治效果。在兴化地区2015年的小鹅瘟疫清的流行中，其发生的原因可能就是与疫苗的质量有直接的关系，因为同期使用扬州威克生物制品有限公司生产的小鹅瘟活疫苗（种鹅用）的母鹅所产的种蛋孵化出的雏鹅均未见发病。当然，疫苗免疫失败除了疫苗本身的原因外，疫苗的保存不当也会造成疫苗的失效，从而影响免疫效果。在2017年度的防控计划中，全部改用了扬州威克生物制品有限公司生产的小鹅瘟活疫苗（S YG26-35株），同时在生产季节到来之前对2016年污染比较严重的孵坊进行彻底消毒。从疫情监测的结果看，疫情得到了很好的控制，在两个月的监测期中只发现了3起小鹅瘟病例。在发现的病例中，雏鹅均来源于同一孵坊，提示可能是由于孵坊污染GPV所致，因为该病毒对环境的抵抗力相当强，污染之后清除的难度比较大，可能是导致消毒不彻底的原因。

[1]贾月楼.一起小鹅瘟疫情的实验室诊断[J].中国畜禽种业，2011，7（11）：141-142.

[2]刘兵.小鹅瘟细胞适应毒的培育及其特性的研究[D].扬州大学，2012.