宁夏地区奶牛副结核病的血清学调查

高海慧 康晓冬

（宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川750002）

宁夏地区奶牛副结核病的血清学调查

高海慧 康晓冬*

（宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川750002）

为了解宁夏地区奶牛副结核病的发病与流行情况，我们于2017年5月～7月对宁夏奶牛养殖区的9个奶牛养殖场按照5%的比例随机采血1796份，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测奶牛副结核病血清抗体。结果显示，存在副结核血清阳性牛，各场奶牛阳性率在1.78%～15.15%不等，样品血清平均阳性率为4.29%；表明该病在宁夏奶牛养殖场中存在，感染处在中等水平。

宁夏 奶牛 牛副结核 流行病学调查

牛副结核病是由副结核分枝杆菌引起的以牛慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的人畜共患传染病[1]，根据菌株培养特性及致病力可将该菌分为3个亚型，即Ⅰ型（羊型）、Ⅱ（牛型）及Ⅲ型（生物中间型），不同亚型培养方法不尽相同[2]，该病主要由消化道感染，处于排菌期的牛，通过粪便、乳汁排菌，其他易感牛只通过经口途径感染该菌[3]。副结核分枝杆菌属于胞内寄生菌，对环境抵抗力强，能长时间在饲料、水源、土壤等被污染环境中存在，呈世界性分布，我国最早在内蒙古发现牛副结核病。该病可造成奶牛体重下降、生产性能下降、产乳量降低、多种疾病的产生，给畜牧养殖业带来巨大的经济损失，严重影响养殖业的健康发展，更严重地威胁着公共卫生安全，需要引起足够重视。为了更全面掌握该病在宁夏奶牛养殖中的流行和分布情况，本研究使用美国爱得士生物科技公司（IDEXX）生产的副结核分枝杆菌抗体ELISA试剂盒对宁夏回族自治区2017年5月～7月以5%比例随机采集的1796头奶牛血清进行流行病学调查。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 被检血清 遴选宁夏石嘴山市、银川市、吴忠具有代表性的9个奶牛养殖场，按照5%的比例随机无菌采取血样1796份，室温下静置2～3h，4℃下3000 r/min 离心5min，析出血清，-20 ℃保存备用，检测前放置于室温条件下自然解冻。

1.1.2 检测试剂 副结核分枝杆菌抗体检测试剂盒：美国爱得士生物科技公司（IDEXX）生产。

1.1.3 主要检测仪器设备 H-1850 R 台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机有限公司），iMark 酶标仪（美国 BIO-RAD 公司），RT-3000 全自动洗板机（深圳雷杜生命科学股份有限公司），微量移液器（德国 Eppendorf 公司）。

1.2 检测方法

1.2.1 奶牛副结核病抗体检测 在抗原包被微量反应板加入100μl已稀释孵育的样品和对照，震荡混匀，18-26℃孵育45min或者2-8 ℃过夜孵育（16-24h），弃去液体，300μl洗涤溶液（20倍稀释）洗涤3次后拍干，每孔加入100μl稀释好的酶标抗体，盖板后18-26℃孵育30min，300μl洗涤溶液（20倍稀释）

洗涤3次后拍干，每孔加入100μlTMB底物，18-26℃遮光孵育10min，每孔加入100μl终止液，450 nm下测量样品盒对照的光密度值。具体操作见副结核分枝杆菌抗体检测试剂盒操作说明。

1.2.2 结果判定 阳性对照平均值大于或等于0.350，阳性对照平均值与阴性对照平均值的比值大于或等于3.00的条件下检测的结果有效，否则试验不成立，应重新检测。

按照以下S/P百分值计算判定每个样品的结果：S/P（%）=100*（O D样本-O D阴性）/（O D阳性-O D阴性）；当样品的S/P%小于或等于45%，判为抗体阳性，样品的S/P%大于45%且小于55%，判为抗体可疑，样品的S/P%大于或等于55%，判为抗体阳性。

2 结果与分析

在9个奶牛场的1796份血清样品中，检出副结核病抗体阳性血样77份，平均血清阳性率为4.29%，在9个被检牛场中有7个奶牛场检出血清阳性牛，阳性率从1.78%～15.15%不等，场感染阳性率为77.78%，具体详见表1。

表1 宁夏地区奶牛副结核病血清抗体检测结果

3 小结与讨论

3.1 检测方法

牛副结核病是一种高传染性和高损伤性的疫病，给我国畜牧业带来严重损失，肉牛和奶牛还需要引起兽医公共卫生重视，所以加强该病的监测和防治具有重要意义。ELISA方法具有敏感、准确、快速、经济、主观因素影响小等优点已成为国内外动物疫病常规的检疫方法，是当前牛副结核检测最常用的方法之一，是大量样本检测的优选方法，为确保ELISA实验的准确性，采样要尽量减少血清样本运输贮藏过程中出现溶血现象。

3.2 宁夏地区奶牛副结核血清学检验结果

近年来，我国畜牧业发展迅速，随着养牛规模的不断扩大，奶牛副结核病的传播之势也迅猛增加，这会对我区畜牧业的健康发展构成一定的威胁。本试验所采集样品来自宁夏不同地区规模化奶牛场，具有一定代表性。检测结果显示，被检9个奶牛场中7个奶牛场存在抗体阳性牛，总体阳性率为4.29%，介于研究报道的我国内蒙古，黑龙江、湖北、四川、安徽、江苏6个省市1.22%-8%的阳性率[4]，证明该病在宁夏地区的感染处于中间水平，但是随着养牛业的快速发展和牛只的频繁交易，该病会继续传播蔓延，需高度重视。

3.3 宁夏地区奶牛副结核病的防控

第一，加强饲养管理，营造良好的卫生环境，制定科学的免疫接种方案，定期开展奶牛副结核病流行病学调查；第二，加强畜群奶牛副结核病净化工作，及时检出、隔离、淘汰感染牛，冻精必须经过严格的检查，确保没有奶牛副结核病污染的才能投入使用；第三，加强检疫，加强牛只引进检疫，鼓励自繁自养，防止引入病原。

[1]田克恭.人与动物共患病[M].北京：中国农业出版社，2013.

[2] Castellanos E，de Juan L，Domnguez L，et al.Progress inmolecular typing of subspecies paratuber-culosis [J].Res Vet Sci，2012，92 （2）：169-179.[C]Arsenault RJ，Li Y，Bell K，Doig K，Potter A，Griebel PJ，Kusalik A，Napper S.Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis inhibits gamma interferon-induced signaling in bovinemonocytes：insights into the cellularmechanisms of Johne's disease[J].Infection and immunity，2012，80（9）：3039-3048.

[3]Manning E，Collins M.Mycobacterium avium subsp .paratuberculosis：pathogen，pathogenesis and diagnosis[J].Revue scientifique et technique（International Office of Epizootics），2001，20（1）：133-150.

[4]崔金磊.我国6省市牛副结核病流行病学调查[D].内蒙古农业大学，2016.

宁夏地区奶牛副结核病流行病学调查及快速诊断技术研究，项目编号：NKYJ-17-09

高海慧（1990-），女，宁夏盐池人，助理研究员，主要从事预防兽医学研究工作。

康晓冬