黄精根系VA真菌的侵染情况及其对黄精生长的影响

韦中强++韩如刚++李娜++韩量++秦静

摘要 采用菌根应用技术，对黄精根系VA真菌的侵染情况及其对黄精生长效应的影响进行研究。结果表明，从黄精根际土壤分离到地球囊霉和摩西球囊霉菌根真菌，土壤含孢量为20.6个/g；黄精根系AM真菌菌丝感染率为17.4%、丛枝感染率为3.1%、泡囊成群分布；孢子接种量不同，黄精生长效应存在差异，说明黄精对VA菌根真菌存在依赖性。

关键词 VA菌根；黄精；侵染情况；生长效应；影响

中图分类号 S567.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）19-0057-02

VA菌根是一种常见的内生菌根，因其菌丝体在胞内呈丛枝状（Arbuscular）和泡囊状（Vese-icular）而得名[1]。由于部分真菌产生丛枝但不产生泡囊，故统称为丛枝菌根（AM）。我国VA菌根真菌广泛存在于各种生态环境中，资源丰富，生态适应性强。其能与绝大多数植物共生，有促进水分和养分吸收利用、提高抗病性、增强耐盐碱和重金属的耐性、提高产量、改善品质，对于实现植物根际土壤生态系统的可持续发展具有重要的实践价值[2]。

黄精[Polygonatum cirrhifolium（Wall.）Royle]为百合科黄精属多年生草本植物的干燥根茎。别名老虎姜、鸡头参，始载于《名医别录》，列为上品，黄精味甘，性平。归脾、肺、肾经。具有补气养阴、健脾、润肺、益肾功能。其性平和，作用缓慢，可作久服滋补之品，自古以来一直被视为延年益寿的珍贵中药，是老年人较理想的补养之品。作为传统名贵中药，近年来，由于黄精新药研制和保健品开发，而野生资源缺乏，人工栽培黄精已成为供求主体。本文对黄精根系VA真菌的侵染情况进行研究，观察其对黄精生长的影响。现将试验结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物。黄精，采自重庆南川三泉镇境内自然环境生长的新鲜植株，同时采集其根际土壤。由重庆市药物种植研究所提供黄精有性种子。

1.1.2 供试菌剂。AM菌剂孢子是课题组采用“湿筛倾析法”分离[3]，在体视显微镜下，从黄精根际土壤0～30 cm深处的土壤中挑取而得。

1.1.3 供试土壤。质地为砂壤土，含速效磷3.22 mg/kg、速效氮52.87 mg/kg、有机质2.01%、速效钾104.8 mg/kg、pH值6.7。土壤田间含水量为18%。土壤经高压湿热灭菌（θ=121℃ φ=0.1 MPa）2 h，冷却备用。每钵装2 kg灭菌土。供试盆栽钵为棕色塑料常规盆栽钵。

1.2 试验方法

1.2.1 黄精AM菌根侵染调查。①根样采集。将根样洗净，将须根先端约1 cm的根段剪下，放入FAA固定液中进行固定，保存备用。②染色制片。根据参考文献[4]中介绍的方法进行制片。③菌根感染率的测定。用测微尺测定感染根段长（含有VA真菌菌丝、泡囊、丛枝、孢子之一者为感染根段）。用Kuwada长度测量软件测量根段长，计算公式[5]如下：

菌根感染率（%）=（VA菌根感染根段长÷观察根段长）

侵染等级划分标准：菌根侵染率0%～5%为1级；6%～25%为2级；26%～50%为3级；51%～75%为4级；76%～100%为5级。

将制片移至Olympus显微镜下进行照相，便于观察清晰的泡囊、菌丝、丛枝、孢子或分枝状吸收结构等，并做好记录。

1.2.2 黄精根际土壤AM真菌含孢量测定及分离鉴定。取带根土样进行混合阴干，称取3份各100 g，用湿筛倾析法分离孢子，将获得的湿筛孢子混合物洗入培养皿中，在体视显微镜下统计计数，计算每1 g阴干土中的孢子数量。在解剖显微镜下依据孢子形态、大小及颜色初步归类，将同类孢子用毛细管或粘有水的拔针转移到载玻片上，将孢子调整到最佳位置，再观察孢子的颜色、形状及大小。后加盖玻片将孢子压破，在显微镜下观察孢壁总厚度、连孢菌丝等特征，参照Schenck和Perez（1988）的VA菌根手冊进行分类鉴定。

1.2.3 黄精盆栽接种AM真菌对生长效应的影响。将湿筛倾斜法分离提取的真菌孢子，在体视显微镜下挑取细胞质均匀一致的生活AMF孢子，42 kHz超声水浴振荡片刻去掉孢子表面杂物，蒸馏水漂洗数次后，将孢子转入Φ 3.0 cm的小玻璃培养皿中，滴加5%氯化铵T-0.04%链霉素-吐温20液[5]，盖好上皿，孢子表面消毒15 min，灭菌蒸馏水漂洗干净，4 ℃冰箱保存备用。分别采用200、400、800、1 200个AMF孢子接种1 kg土壤，以灭菌土壤不接种作对照（CK），3次重复，每钵播种3粒黄精种子，播期2015年2月10日，播后覆土，灭菌蒸馏水浇透。出苗时定苗1株，常规管理。

2 结果与分析

2.1 黄精AM菌根形态观察

由图1可知，黄精丛枝菌根根内孢子呈圆形或近圆形，显微镜下呈浅黄色，表面光滑；泡囊近椭圆形，颜色较深。观察到根内孢子，但相对较少，而泡囊作为营养繁殖体较为丰富。从制片观察到黄精根内菌丝和丛枝分布稀疏，丛枝相对更少。根据计算结果，菌丝和丛枝感染率分别为17.4%、3.1%。由此表明，VA菌根真菌侵染黄精幼根形成了菌根，为菌根药用植物，但感染率不高，这可能与土壤性质、植物本身性质及VA真菌资源等有关，有必要开展AM真菌接种试验。

2.2 黄精根际土壤AM菌根真菌孢子密度及种类

统计结果表明，每1 g土壤中含有20.6个孢子，根据其形态、颜色及大小分为2类：一类孢子形态结构描述为：孢子单生，黄棕色，近圆形，大小250～280 μm。孢壁光滑，孢壁总厚度11 μm，可分3层：外层无色透明，厚约1 m，成熟后常脱落；第2层黄棕色层状壁，8 μm；最内层淡黄色膜状壁，厚约1 μm，连孢菌丝淡黄色或淡黄棕色，直桶形，菌丝宽13～26 μm。连点处有隔，由内壁封闭；另一类孢子形态结构描述为孢子单生，棕色，圆形，孢子表面光滑，大小160～260 μm，孢子壁2层，外层为浅黄色层状壁，厚5 μm，总厚度10 μm。2层紧贴在一起不易分开。连点宽26 μm，距连点下方5 μm有加厚呈柱状的菌丝壁（基部微喇叭形），连丝内部有厚—凹形弯隔。根据鉴定结果，该孢子为地球囊霉（G. geospora Gerdemann，J.W and J.M.Trappe）和摩西球囊霉（G.mosseae Gerd&Trappe），地球囊霉孢子和摩西球囊霉孢子平均每1 g土壤含14.4个和6.2个，分别占总数的69.90%和30.10%。黄精根际土壤AM真菌种群丰度为2（种群丰度—指一个中药材根际土壤中所含VA菌根真菌种的数量）。endprint

2.3 AMF真菌孢子不同接种量对黄精生长效应的影响

在黄精生育期，于2015年11月25日调查黄精生长状况，对黄精的株高、叶面积、单株重量进行统计，统计结果见表1。由表1、图2可知，接种AM真菌处理较对照黄精在生长量方面有所提高，说明AM真菌对黄精的生长有促进作用，黄精对AM真菌存在一定的依赖性。其中，处理C即接种密度为800个孢子/kg土壤时，黄精单株重量达到了2.96 g，较CK增产193.06%。由表1、图3可知，接种AM真菌处理较对照黄精生长良好，植株旺盛，在株高方面显现出优势，说明接种AM真菌有助于黄精根系吸收土壤营养，促进药用植物黄精植株快速生长。

3 结论与讨论

本试验结果表明，不接种处理黄精的生长效应相对较差，不管是株高、叶片面积和单株产量都明显低于接种AMF真菌孢子處理的。说明黄精对AMF存在依赖性，随着接种孢子数量的增加，黄精的生长效应表现更加明显，当接种孢子密度达800个孢子/kg土壤时，黄精株高、叶片面积、单株产量均达最高，但当接种孢子密度达1 200个孢子/kg土壤以上时与接种孢子密度达800个孢子/kg土壤时没有显著差异，说明随着孢子数量的增大，接种过高密度的AM真菌时，菌根就会发生由共生关系转向寄生关系，对植物的生长带来一定负效应。

目前，菌根生物技术是实现经济、生态和社会三效益发展的现代农业新模式的新途径之一。我国的菌根资源相当丰富，但对菌根的研究起步较晚，自20世纪50年代后，才开始菌根研究，并陆续引种和大规模造林工作。目前，许多农业科研机构和农业院校等相继开展了丛枝菌根相关研究课题，使VA菌根研究从实验室阶段开始转向生产应用及推广阶段，其研究的深度和广度也得到了进一步提高。而渝主产药材VA菌根资源调查研究除了李品明等[6]人外，还尚未有其他人涉足。本试验对重庆市主产中药材黄精丛枝菌根的菌丝感染率、丛枝感染率、泡囊数量等级进行了测量和统计，以及土壤含孢量测定和AM真菌种类鉴别。并采用菌根应用技术，开展了AM真菌接种试验，观察菌根真菌对黄精的生长效应，接种一定数量的AM真菌可显著提高黄精的产量。本试验结果可为进一步对药用植物黄精菌根的深入研究以及菌根生物技术在中药材生产上的广泛应用提供科学依据，并打下坚实的理论基础[7-8]。

4 参考文献

[1] 弓明钦，陈应龙，仲崇禄.菌根研究及应用[M].北京：中国林业出版社，1997：1-216.

[2] 陈敏，王和勇，廖志华，等.发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究进展[J].天然产物研究与开发，2000，12（3）：98-102.

[3] 郭良栋.内生真菌研究进展[J].菌物系统，2001，20（1）：148-152.

[4] 刘润进.丛枝菌根及其应用[M].北京：科学出版社，2000：1-45.

[5] 杨晓红，曾明，李道高，等.丛枝菌根真菌的垂直平板定时转动培养及菌丝生长观察[J].菌物系统，2001，20（3）：358-361.

[6] 李品明，韩如刚，刘杰，等.中药材植物根际土壤VA菌根多样性研究[J].湖南农业科学，2011（2）：141-142.

[7] 祝英，熊俊兰，吕广超，等.丛枝菌根真菌与植物共生对植物水分关系的影响及机理[J].生态学报，2015，35（8）：2419-2427.

[8] 字肖萌，高江云.不同真菌对2种药用石斛种子共生萌发的效应[J].中国中药杂志，2014，39（17）：3238-3244.endprint