山西猪伪狂犬病毒gE基因主要抗原区的遗传变异分析

孟 帆，樊振华，吴 忻，姚敬明，王娟萍，米瑞娟，薛翼鹏，赵 岳

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032）

山西猪伪狂犬病毒gE基因主要抗原区的遗传变异分析

孟 帆，樊振华，吴 忻，姚敬明，王娟萍，米瑞娟，薛翼鹏，赵 岳

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032）

根据GenBank中收录的PRV Becker株的gE基因序列，设计了合成1对引物，对山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE部分基因进行了PCR扩增，并进行克隆与序列分析。经测序，山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE部分基因核苷酸序列长度为997 bp，编码322个氨基酸。测序后对山西流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列和推导出的氨基酸序列与18株PRV参考株进行了遗传变异分析，结果显示，山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列与18株PRV参考株之间同源性为97.8%～100%，其中与YY株（湖南）、SC-1-2015株（四川）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（广东）及 DL14-08株（长春）同源性最高，均为100%，与75V19株（比利时）同源性最低，为97.8%。山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列推导的氨基酸序列与18株PRV参考株之间同源性为96.1%～100%，其中与YY株（湖南）、SC-1-2015株（四川）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（广东）及DL14-08株（长春）同源性最高，均为100%，与Rice（美国）同源性最低，为96.1%。山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因序列的遗传进化分析表明，山西PRV流行株属于2012年以来分离的PRV变异株群，与YY株和HNXX2012株亲缘关系较近，与欧洲和美洲分离株亲缘关系较远。

猪伪狂犬病毒；gE基因；抗原区；遗传变异

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies v irus，PRV）引起的猪等多种家畜和野生动物共患的一种烈性自然疫源性传染病，患病动物主要表现特征是发热、奇痒（猪除外）、脑脊髓炎[1]。感染该病后只有猪可以存活，猪也是PRV唯一的自然宿主和病毒储藏者[2-3]。有学者研究发现，猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪瘟病毒（CSFV）和PRV是猪群中3种能引起神经症状的免疫缺陷性疫病病毒，三者中以PRV单独感染情况最为严重[4]。PR作为猪群重要的传染病之一，严重影响着养猪业的健康发展，并对养猪业造成巨大的经济损失。在美国和部分欧洲国家饲养的猪群中，PRV已经得到根除，我国《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》中也明确提出，到2020年全国所有种猪场达到猪伪狂犬病净化标准。

一般规模化猪场控制猪伪狂犬病的主要方法是免疫接种弱毒疫苗或gE基因缺失疫苗[5-6]，从而使该病得到有效控制。但自2012年开始，我国许多省市一些免疫过gE基因缺失疫苗后仍相继暴发疑似猪伪狂犬病的传染病[7-13]，2013年以来，山西省多个规模化猪场疫苗免疫后也发生PR。

本研究于2016年在山西省某发病猪群中分离到1株PRV，对其进行了病毒分离鉴定，并对其gE基因主要抗原区进行了克隆测序，与Genbank收录的其他18株PRV流行株的核苷酸及推导氨基酸序列进行比较，构建遗传发育进化树，进而分析山西省目前的PRV分子流行病学特点，旨在为控制山西省猪伪狂犬病的传播和选用合适的疫苗提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 PRV阳性病料采集

2016年在山西省某疑似猪伪狂犬病发病猪场，无菌采集疑似猪伪狂犬病剖检猪的淋巴结、扁桃体和脑组织等作为检测PRV的材料，经PCR鉴定为PRV阳性，－70℃保存。

1.2 主要材料

猪伪狂犬病毒PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。DL2000 DNA Marker，TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0和TaKaRa LA PCRTMKit Ver.2.1试剂盒均由TaKaRa公司提供。

1.3 试验方法

1.3.1 PRV病毒的分离与鉴定 参照文献[14]的方法分离培养病毒。收获的细胞毒按猪伪狂犬病毒PCR检测试剂盒操作说明进行检测，共分离出1株PRV，－70℃保存备用。

1.3.2 引物设计及合成 根据GenBank中收录的PRV Becker株的基因序列，应用Primer Permier 5.0软件，设计合成1对用于扩增gE基因部分序列的特异性引物，上游引物PRVF:5′-CTTTCCGCCGAG ACGACCC-3′；下游引物 PRVR：5′-TCATCACGAG CACGTACAG-3′，预期扩增片段长度约为1000bp。引物由北京华大基因公司合成，-70℃保存备用。

1.3.3 PRV病毒基因组的提取 参照文献[14]的方法提取PRV病毒基因组DNA，用适量的DEPC水溶解，-70℃保存备用。

1.3.4 PRV gE基因的PCR扩增 把提取的病毒DNA作为模板扩增gE基因。反应体系为50 μL：2×GC BufferⅠ25 μL，dNTP Mixture 8 μL，TaKaRa LATaq0.5 μL，上下游引物（20μmol/L）各 1 μL，模板2.5 μL，用 ddH2O补充至 50 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；进入循环94℃变性45 s，62℃退火45s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min。结束反应后，取PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.3.5 PRV gE基因的克隆及测序 目的片段经凝胶回收试剂盒回收后，克隆至pMD18-T载体，并转入大肠埃希菌DH5α克隆，而后进行PCR鉴定，由北京华大基因公司进行测序。

1.3.6 PRV gE基因序列的比对分析 将获得的山西流行株gE基因主要抗原表位区的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列用DNAStar生物信息学分析软件包与已发表在GenBank中的PRV参考株的gE基因和推导出的氨基酸序列进行遗传变异分析，以查清山西流行株的遗传变异情况。

2 结果与分析

2.1 PRVgE基因的扩增结果

经PCR扩增后，凝胶电泳结果显示，扩增出与预期片段大小相同的约为1 000 bp的扩增条带（图 1）。

2.2 PRVgE基因核苷酸序列分析

经测序，山西PRV流行株（SXPRV）的gE部分基因核苷酸序列长度为997 bp，编码322个氨基酸。对获得的山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因序列与GenBank中登录的YY株（湖南）、75V19株（比利时）、Rice株（美国）、SC-1-2015株（四川）、LA株（山东）、DUL34pass株（德国）、HB-HS株（河北）、CL-15株（阿根廷）、Ea株（湖北）、Min-A株（河南）、Yangsan株（韩国）、P-Pro株（马来西亚）、PRV-SH株（上海）、Kanplan株（匈牙利）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（广东）、FJLY-2P2014株（福建）及 DL14-08株（长春）18株PRV参考株的gE基因序列进行了核苷酸序列相似性比较。由序列分析可知（图2），19株PRV流行株之间的gE基因序列同源性均较高，介于97.3%～100%之间，山西PRV流行株的gE基因序列与18株PRV参考株之间同源性为97.8%～100%，其中，与YY株（湖南）、SC-1-2015株（四川）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（广东）及DL14-08株（长春）同源性最高，为100%，与75V19株（比利时）同源性最低，为97.8%。

2.3 PRV分离株gE基因氨基酸序列分析

对获得的山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列推导的氨基酸与GenBank中登录的18株PRV参考株进行了氨基酸序列相似性比较，结果发现，19株PRV流行株之间的gE基因核苷酸序列推导的氨基酸同源性都较高，介于95.2%～100%，山西PRV流行株与18株PRV参考株之间同源性为96.1%～100%，其中，与YY株（湖南）、SC-1-2015株（四川）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（广东）及DL14-08株（长春）同源性最高，为100%，与Rice（美国）同源性最低，为96.1%（图3）。

2.4 PRVgE基因系统发生树分析

在山西PRV分离株和GenBank中登录的18株PRV参考株的gE基因核苷酸相似性的基础上进行了遗传进化树分析，结果发现，遗传进化树分为2个大的基因群，欧洲和美洲分离株位于一个大的基因群；亚洲分离株位于另一个大的基因群。其中，亚洲基因群又分为2个小支，一支主要是2012年前分离的PRV毒株群，另一支是2012年以来分离的PRV变异株群，山西PRV流行株就属于变异株群，山西PRV流行株与YY株和HNXX2012株亲缘关系最近，与欧洲和美洲分离株亲缘关系最远（图4）。

3 讨论

猪伪狂犬病对养猪业造成的经济损失是巨大的。猪场一旦暴发猪伪狂犬病，妊娠母猪感染后会发生流产、产死胎、木乃伊胎和弱仔，特别以产死胎较为严重；新生仔猪出现神经症状[15-16]，15日龄内死亡率达100%，仔猪感染后发热、腹泻、呼吸困难、肌肉震颤、麻痹、共济失调；感染的成年猪多呈隐性，长期带毒排毒，是最危险的传染源，对猪场生产的影响非常严重。樊振华等[17]曾于2009—2011年间对山西省11个地市的58个种猪场作了猪伪狂犬病分子流行病学调研，结果发现，猪场猪群感染猪伪狂犬病病毒比较普遍，而且大部分猪场免疫情况都比较好，但也有一部分猪场对免疫不重视。对种猪场来说，猪伪狂犬病危害性非常大，传染性比较强，今后需要对该病的防疫免疫工作进一步加强。近几年来，猪伪狂犬病的感染在我国猪场越来越严重，尤其许多使用猪伪狂犬基因缺失疫苗免疫的规模化猪场，山西省也不例外。因此，有必要对山西PRV流行株进行遗传进化分析，以研究山西PRV流行株的变异情况，为控制山西省猪伪狂犬病的传播提供参考。

PRV属于疱疹病毒科ɑ亚科，基因组为线状的双股DNA，全长约150 kb，GC含量很高，达73%，可编码70～100种蛋白质。其中，gE糖蛋白基因是病毒的重要毒力基因之一，也是存在于所有PRV野毒株的一个基因，对病毒在宿主体内的神经向性和病毒从细胞到细胞之间的传播起重要作用，缺失gE基因，病毒的毒力将大幅下降，但对病毒在宿主体内的复制与免疫原性没有影响[18]，因此，应广泛应用gE基因缺失疫苗进行疫苗接种。对gE基因进行遗传变异分析将有助于了解PRV流行株变异情况。

为了了解山西PRV流行株的变异情况，本研究对山西PRV分离株包含主要抗原表位区的gE部分基因进行了遗传变异分析，通过对包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸相似性分析发现，19株PRV流行株之间的gE基因序列同源性介于97.3%～100%，说明世界各地PRV分离株的基因序列相似性较高；其中，山西PRV流行株的gE基因序列与18株PRV参考株之间同源性为97.8%～100%，可见，山西PRV流行株与其他PRV流行株的基因序列差异也不大。另外，对19株PRV流行株在gE基因核苷酸相似性的基础上进行遗传进化分析发现，山西PRV流行株属于2012年以来分离的PRV变异株群，说明山西PRV流行株在分子水平上也发生了变异，病毒毒力也可能随之发生了改变，这也可能是部分免疫过gE基因缺失疫苗的规模化猪场发生伪狂犬病感染的原因。而且山西PRV流行株与YY株和HNXX2012株亲缘关系最近，与欧洲和美洲分离株亲缘关系最远，说明山西PRV流行株可能来源于相近的湖南株及湖北株，这可能与近年来全国生猪市场环境好，山西省规模化养猪持续发展，从不同地区大量引种和跨地区的生猪流动有关，因此，应该加强生猪运输的检疫工作。对包含主要抗原表位区的gE基因推导的氨基酸相似性分析发现，19株PRV流行株之间的gE基因氨基酸序列同源性介于95.2%～100%，其中，山西PRV流行株的gE基因氨基酸序列与18株PRV参考株之间同源性为96.1%～100%，这些与核苷酸相似性研究结果是相对应的。本研究从分子水平研究了山西省PRV流行株的遗传变异情况，以期为山西地区PRV的防控提供理论依据。

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Genetic Variation Analysis ofgEAntigen Epitope of Pseudorabies Virus Isolated from Shanxi Area

MENGFan，FANZhenhua，WUXin，YAOJingming，WANGJuanping，MI Ruijuan，XUE Yipeng，ZHAOYue
（Institute ofAnimal Husbandryand Veterinary，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

Using a pair of primers designed according to the gE nucleotide sequence of PRV Becker strain from GenBank,the part of gE gene of Shanxi PRV strain containing the main antigenic regions encoding were amplified by PCR,and then PCR product was cloned and sequenced,a fragment of 997 bp carried out could encode 322 amino acids.The part of gE gene nucleotide sequence of Shanxi PRV strain containing the main antigenic regions encoding and amino acid sequence deduced were used to analysis the genetic variation with 18 PRV strains.The results showed that the homologies ofnucleotide sequences ofShanxi PRV strain to the 18 PRV strain were 97.8%-100%,the highest homologywas 100%between Shanxi PRVstrains and YY strains（Hunan）,SC-1-2015 strain（Sichuan）,HNXX2012 strain（Hubei）,HN-DZ strain（Guangdong）and DL14-08 strain（Changchun）,the lowest homology was 97.8%between Shanxi PRV strain and 75V19 strain（Belgium）.The homologies of amino acid sequences of Shanxi PRV strains to the 18 PRV strain were 96.1%-100%,the highest homology was 100%between Shanxi PRV strain and YY strains（Hunan）,SC-1-2015 strain（Sichuan）,HNXX2012 strain（Hubei）,HN-DZ strain（Guangdong）and DL14-08 strain（Changchun）,the lowest homology was 96.1%between Shanxi PRV strain and Rice（America）.The genetic evolution analysis showed that Shanxi PRV strain belonged to the PRV mutation group isolated after 2012,it had the closer relationship with YY strains and HNXX2012 strains,and the farther relationship with the European strains and the American strains.

pseudorabies virus;gE gene;antigen epitope;genetic variation

S858.28

A

1002-2481（2017）11-1844-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.11.27

2017-06-26

山西省重点研发计划项目（201603D221023-1）；山西省农业科学院畜牧兽医研究所所级项目（XMS201503）

孟 帆（1980-），女，山西太原人，助理研究员，硕士，主要从事动物疫病分子生物学检测与诊断技术的研究工作。樊振华为通信作者。