狼尾草中草药型青贮添加剂的筛选及优化

李振武++陆烝++黄秀声++林忠宁++应朝阳++韩海东

摘要 本研究旨在从10种中草药中筛选出2～3种组成复方中草药型青贮添加剂，使得该青贮添加剂能够促进狼尾草自带的乳酸菌生长，进而达到改善狼尾草青贮发酵品质的目的。首先采用单因素试验研究了不同浓度的5种补益类中草药和5种清热解毒类中草药提取液对乳酸菌（从新鲜狼尾草叶片表面分离）生长的影响，以对乳酸菌生长的促进率为指标，筛选出黄芪、五味子和金银花组成复方中草药型青贮添加剂；再采用正交试验对该复方中草药型青贮添加剂各组分含量进行优化。结果表明，狼尾草中草药型青贮添加剂的最优配方为2.00%黄芪提取液、1.00%五味子提取液、1.00%金银花提取液。

关键词 狼尾草；中草药；青贮添加剂；优化

中图分类号 S816.5+3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）20-0221-003

Screening and Optimization of Chinese Herbal Medicine Additives for Chinese pennisetum silage

LI Zhen-wu 1 LU Zheng 1 HUANG Xiu-sheng 1，2 LIN Zhong-ning 1 YING Zhao-yang 1，2 HANG Hai-dong 1 *

（1 Agricultural Ecology Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou Fujian 350013； 2 Fujian Engineering and Technology Research Center for Circular Agriculture）

Abstract The purpose of this study was to screen out 2-3 kinds of Chinese herbal medicine composition from 10 kinds of Chinese herbal medicine to compose Chinese herbal medicine silage additives，which could promote the growth of lactic acid bacteria isolated from Chinese Pennisetum，so as to improve the quality of Chinese Pennisetum silage.Firstly，single factor experiments were conducted to evaluate the effects of different concentrations of 5 kinds of tonic Chinese herbal medicine and 5 kinds of heat clearing and detoxifying herbs extract on growth of lactic acid bacteria（isolated from fresh leaves of Chinese pennisetum）in vitro.The results showed that Astragali radix，Schisandrae chinensis fructus and Lonicerae japonicae Flos were the best components of the compound Chinese herbal medicine silage additive which promoted the growth of lactic acid bacteria.Furthermore，the orthogonal tests were used to optimize the doses of the compound Chinese herbal medicine silage additive.The results showed that the optimum doses of the compound Chinese herbal medicine additive for Chinese pennisetum silage were of 2.00% Astragali radix extract，1.00% Schisandrae chinensis fructus extract and 1.00% Lonicerae japonicae Flos extract.

Key words Chinese pennisetum；Chinese herbal medicine；silage additives；optimization

狼尾草（Chinese pennisetum）為多年生禾本科牧草，具有产量高、耐刈割、适口性好等特点，是草食家畜的优质青饲料，在南方红壤地区得到了广泛的推广和应用[1]。狼尾草的盛产期集中在夏季，在夏季对狼尾草进行青贮有利于狼尾草季节性均衡供应和提高其利用效率。近年来科技工作者对狼尾草的青贮技术开展了大量的研究，主要集中在狼尾草低水分青贮、混合青贮和添加剂青贮等方面[2-4]。目前，狼尾草青贮应用较多的青贮添加剂为乳酸菌制剂，市场上乳酸菌制剂是通用型的青贮添加剂，所用乳酸菌主要分离自外界环境，这些菌株由于生活环境与狼尾草生长环境相差甚远，致使乳酸菌在狼尾草青贮料中的适应力不强、生长性能差，导致青贮效果不理想。因此，筛选出价格便宜并可以改善狼尾草青贮品质的专用青贮添加剂，对狼尾草在南方养牛业中的高效利用具有重要的意义。前人研究表明，许多补益类中草药对乳酸菌的生长有促进作用，许多清热解毒类中草药有抑菌作用[5-6]。本研究正是利用中草药的这一特性，从狼尾草中分离乳酸菌，以对乳酸菌生长的促进率为指标，筛选出3种中草药组成狼尾草专用的中草药型青贮添加剂。endprint

1 材料与方法

1.1 试驗材料

供筛选作为狼尾草青贮添加剂的中草药有黄芪、五味子、枸杞、当归、熟地5种补益类中草药以及金银花、青蒿、瓜蒌、鱼腥草、决明5种清热解毒类中草药。以上10种中草药均购自福建医药大学国医堂。乳酸菌由生长旺盛的闽牧2号杂交狼尾草叶片表面分离纯化，闽牧2号杂交狼尾草由福建省农业科学院农业生态研究所牧草品种资源圃提供。

1.2 试验设计

1.2.1 单因素试验。对以上10种中草药添加剂分别进行单因素试验，以对乳酸菌生长的促进率为指标，研究不同添加剂不同浓度对狼尾草叶片表面乳酸菌增殖的影响。从添加剂的成本考虑，添加剂的添加浓度不宜超过2.00%，因而选择的添加剂浓度分别为0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%。

1.2.2 正交优化试验。在单因素试验的基础上，从补益类中草药中筛选出黄芪、五味子，从清热解毒类中草药中筛选出金银花组成复方中草药型青贮添加剂。采用正交试验对添加剂各组分添加量进行优化。试验采用3因素3水平5重复的正交设计，选用L9（33）正交表，试验因素为五味子提取液、黄芪提取液、金银花提取液。正交试验各因素水平表如表1所示。

1.3 试验方法

1.3.1 中草药型青贮添加剂制备。将各供试中草药置于60 ℃干燥箱中烘至恒重，称取中草药25 g，用250 mL去离子水浸泡30 min后煎煮，沸后文火煎煮30 min，用孔径为1 mm的4层纱布进行第1次过滤得到第1次滤液和药渣。然后在药渣中加入150 mL去离子水，文火煎煮30 min后进行第2次过滤，弃掉滤渣。将2次所得滤液合并后，文火煎煮浓缩至25 mL，使药液终浓度为1 g/mL，即为100%中草药原液，将中草药原液高压灭菌后，置于4 ℃ 冰箱保存备用[7]。

1.3.2 狼尾草乳酸菌提取纯化及鉴定。称取生长旺盛、新鲜的闽牧2号狼尾草叶片5 g，将其剪成长1 cm左右的小段，放入50 mL的MRS液体培养基中37 ℃静止培养72 h，取培养72 h的狼尾草MRS发酵液0.5 mL接种于9.5 mL的MRS液体培养基中，室内厌氧培养。连续培养5代后，用灭菌的移液器吸取0.2 mL培养液滴入HORIBA B-212型微量pH计测定pH值。将72 h之后pH值高于4.0的菌液淘汰，之后继续继代培养，随时淘汰pH值高于4.0的菌液。经过10代左右的继代培养，选出一个菌系，其pH值继代培养稳定且低于4.0。取0.5 mL生长旺盛的菌液，转入装有4.5 mL无菌水的试管中，充分混匀，依照该方法稀释直到10-8倍，然后取0.1 mL在含有琼脂的MRS培养基平板上涂皿，30 ℃静止厌氧培养。从平板中选择典型的菌落在同样的平板上划线分离培养，直到得到纯的单个菌株，保存备用[8]。

根据凌代文[9]的方法对菌株进行鉴定。凡是革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌，然后进行乳酸菌属的鉴定试验。乳酸菌属的鉴定需要做硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、H2S产生试验、运动性试验、15 ℃及45 ℃的生长试验。

1.3.3 添加剂对乳酸菌生长的影响。从斜面上挑取适量菌苔，于MRS平板上划线活化，倒置于37 ℃培养箱中培养，至菌体生长。挑取平板上的单菌落，接入MRS液体培养基中，静置于37 ℃培养箱中培养至菌液浑浊，用生理盐水对菌液进行106倍稀释后，置于磁力搅拌器上搅拌30～40 min。用2×MRS液体培养基将受试药物进行梯度稀释，获得4.00%、3.00%、2.00%、1.00%、0.50%的梯度溶液。在96孔板上加入梯度溶液100 μL（以2×MRS液体培养基为对照，药物浓度为0.00%），并加入100 μL工作菌液，各药物终浓度为0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%，每个浓度点设5个平行。由于有些中草药提取液的颜色很深，恐有干扰，故另取一个96孔板，以100 μL生理盐水代替工作菌液，用于对各浓点的体系进行监控，并对各浓度体系的本底值进行检测，各设2个平行。将96孔板静置于37 ℃培养箱中培养48 h后，经振荡混匀，用酶标仪检测OD600值。

1.4 数据统计分析

将试验组及对照组的OD600值扣除对应浓度点的本底值，即为各浓度点的OD600值。以促进率表征中草药提取液对乳酸菌生长的影响，促进率（%）=（试验组的OD600 ÷ 对照组的OD600 -1）×100。用Minitab16软件进行数据统计分析[10]。单因素试验数据采用Minitab16单因子方差分析，使用Tukey法对各组间平均数进行多重比较，结果表示为平均值+标准差；正交试验数据的直观分析采用Minitab16的田口分析得到均值响应表；正交试验数据的方差分析采用Minitab16的一般线性模型，使用Tukey法配对比较，检验中使用校正的SS。

2 结果与分析

2.1 狼尾草叶片表面乳酸菌的鉴定

从狼尾草叶片表面分离的菌株革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶试验为阴性、硝酸盐还原试验为阴性、不液化明胶、不产生硫化氢、无运动性都能在15 ℃和45 ℃条件下生长，根据乳酸菌定义[11]，确定为乳杆菌属。

2.2 中草药提取液对乳酸菌生长的影响

由表2、3可知，不同类型的中草药提取液对乳酸菌的作用不同，即使是同一种中草药提取液的不同浓度对乳酸菌的作用也不尽相同。5种补益类中草药提取液中，各浓度的五味子、黄芪、当归提取液均表现出对狼尾草乳酸菌生长有促进作用，当添加剂浓度越大时黄芪、当归提取液对乳酸菌的促进作用越强，而五味子提取液则存在一个峰值，达到峰值以后，随着添加剂浓度的提高，对乳酸菌的促进作用反而下降；枸杞提取液对狼尾草乳酸菌生长的作用不明显，低浓度对乳酸菌生长有轻微的促进作用，高浓度对乳酸菌生长有轻微的抑制作用；熟地提取液在各浓度均表现出对狼尾草乳酸菌生长的抑制作用，添加剂浓度越大抑制作用越强。在试验设定的添加浓度范围内，5种补益类中草药中，1.00%五味子提取液对乳酸菌生长的促进作用最强，促进率为15.60%；2.00%黄芪提取液次之，对乳酸菌生长的促进率为13.88%。endprint