基于等温滴定量热技术探究黄芩质量表征新方法

李桐　张昊　田学浩　王辉　任广喜　荆文　光徐冰　褚福浩　王鹏龙　雷海民

[摘要]黃芩黄连药对水煎自沉淀现象已被广泛关注，产生自沉淀现象的本质是药对中酸碱性活性成分相互作用形成难溶性分子复合物，本试验设计基于中药配伍后有效成分间的相互作用，探索将等温滴定量热技术（isothermal titration calorimetry， ITC）应用于表征黄芩药材质量的可行性，建立以活性成分群为指标衡量药材质量的新方法。以不同批次黄芩药材（包括市售的3批黄芩药材和市场上常用做以次充好的黄芩苗）作为研究对象，应用ITC分别测定黄连中代表性功效成分小檗碱（25 mmol·L-1）与不同批次黄芩水煎液间相互作用能量值，将小檗碱滴定空白水溶液的能量变化（251 μJ）作为空白对照，结果显示以小檗碱为标准物质，滴定不同批次黄芩水煎液中黄芩苷类成分的热量变化由高到低依次为黄芩A（-31720 μJ）、黄芩B（-29283 μJ）、黄芩C（-20895 μJ）、黄芩苗（-2153 μJ）。其中小檗碱滴定黄芩苗的热量变化显著低于3批黄芩药材。应用紫外分光光度法以黄芩苷计测定不同批次黄芩水煎液在最大吸收波长处的吸光度值。紫外测定结果显示，相同稀释条件的不同批次药材吸光度由高到低依次为黄芩A（0372）、黄芩B（0333）、黄芩C（0272）、黄芩苗（0124），且黄芩苗吸光度显著低于前三组。ITC滴定与紫外测定结果相吻合，证明ITC能用于表征黄芩药材质量，基于ITC建立的以一类活性成分为指标评价黄芩药材质量的方法是简便、科学且可行的，此试验为构建更加全面、系统地表征药材质量提供了新思路。

[关键词]等温滴定量热； 分子相互作用； 紫外分光光度法； 黄芩； 质量

[Abstract]It has been focused on that there will be precipitates when decoction of Scutellariat Radix mixed with Coptidis Rhizoma Precipitation was derived from interaction between acidic and basic compounds This study was based on the interaction between active ingredients after compatibility， strived to explore whether it was feasible to judge the qualities of different Scutellariat Radix by isothermal titration calorimetry （ITC）， build a new method established to characterize the qualities of traditional Chinese medicine by taking a series of active ingredients as index We selected Scutellariat Radix （including three batches of different Scutellariat Radix bought from market and immature Scutellariat Radix which usually was used as adulterant） in different batches as the samples First， we used ITC to determine the binding heat of the reactions between berberine and the decoctions of different Scutellariat Radix The test showed that the binding heat of berberine titrated Scutellariat Radix was Scutellariat Radix A （-31720 μJ）， Scutellariat Radix B （-29283 μJ）， Scutellariat Radix C （-20895 μJ） and immature Scutellariat Radix （-2153 μJ）， respectively We chose deionized water titrated by berberine （251 μJ） as control The heat change of berberine titrated immature Scutellariat Radix was much less than berberine titrated Scutellariat Radix Then we determined the absorbance of different decoctions of Scutellariat Radix by UV Spectrophotometry on the maximum absorption wavelength， and the result is： Scutellariat Radix A （0372）， Scutellariat Radix B （0333）， Scutellariat Radix C （0272）， immature Scutellariat Radix （0124） The absorbance of immature Scutellariat Radix was also less than Scutellariat Radix The result of ITC assay was corresponded to UV spectrophotometry test In conclusion， ITC could be used to characterize the quality of Scutellariat Radix The new method to characterize the qualities of traditional Chinese medicine by taking a kind of active ingredients as index building by ITC was simple， scientific and feasible.endprint

[Key words]isothermal titration calorimetry （ITC）； UV spectrophotometry； molecular interaction； Scutellaria baicalensis； quality control of traditional Chinese medicine

中药是世界公认的复杂体系，其化学成分多样，作用机制复杂，单味药经配伍组成复方用于临床，更是中药的一大特色。在中药现代化、国际化的进程中，最大的障碍就是中药的质量难以标准化。近年来，越来越多的学者提出，以单一成分来判断和检测中药质量的好坏是有很大局限性的，不能体现中药多成分、多靶点的特点，需要建立一种整体的中药质量评价方法[14]。

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。临床上用于治疗呼吸道感染、急性菌痢、病毒性肝炎、过敏性疾病和妇科疾病等[5]。由于产地、采收、加工、贮藏等诸多因素的影响，导致市场上黄芩质量良莠不齐。

黄芩黄连药对在中医临床上的使用非常广泛，如黄连解毒汤、葛根黄连汤等。传统中医理论认为黄芩、黄连二药皆为苦寒，属相须配伍，有泻火解毒的功效。诸多研究表明黄芩黄连药对水煎液会产生明显自沉淀现象[6]，并且本课题组前期研究发现，该自沉淀主要是黄连中的小檗碱类成分和黄芩中黄酮类成分（黄芩苷、汉黄芩苷、木蝴蝶苷等）发生非共价键结合的缔合反应，生成酸碱复合物沉淀，且该沉淀具有很好的神经保护活性[7]。因此，根据小檗碱与黄芩中众多黄酮类化合物的相互作用为切入点，以反应过程中释放的能量变化为指标，通过ITC技术测定不同黄芩水煎液与小檗碱水溶液相互作用的大小，表征不同黄芩中多种活性成分含量高低，从而判断黄芩药材质量的好坏。

ITC通过微量量热仪连续、准确地检测和记录一个变化过程的量热曲线，通过成分间相互作用的能量变化，计算反应的热力学和动力学信息。目前，主要应用于分子之间的相互作用特征鉴定、酶动力学以及中药注射液用药相容性的研究[810]，本文旨在利用ITC技术测定的热量曲线表征黄芩中能与小檗碱反应的黄酮类成分的含量。

1材料

NANO ITC等温滴定量热仪和脱气站Degassing Station（美国TA公司）； 电子天平（YP3002，上海佑科仪器仪表有限公司）；1/10万电子天平（型号ME55，瑞士梅特勒托利多公司）；京立牌LD52B型台式低速离心机；紫外可见分光光度计（日立UH5300，日立高新技术公司）；3批市售黄芩（由北京中医药大学中药资源系刘春生教授鉴定均为唇形科植物黄芩S baicalensis的干燥根）；黄芩苗（由北京中医药大学中药资源系刘春生教授鉴定为未到采收期的唇形科植物黄芩S baicalensis 的干燥根）。

2方法与结果

21药材水煎液的制备

将购得的4批市售药材分别编号为：黄芩A、黄芩B、黄芩C、黄芩苗。等量称取2 g，加10倍量水冷凝回流煎煮30 min后水煎液趁热离心，分取上清液即得黄芩水煎液。

22应用ITC测定成分相互作用

221供试品溶液的制备为了使拟合得到的热力学参数准确可靠，应用ITC进行分子热力学参数测定过程中，需要反应池样品充分消耗，最终得到S形等温线[11]。因此，根据前期预试验的摸索，将上述水煎液用去离子水稀释32倍，微孔滤膜滤过备用。称取小檗碱588 mg用水稀释到10 mL配成25 mmol·L-1的小檗碱水溶液备用。供试品溶液滴定前放入脱气站（degassing station）中30 ℃恒温脱气处理20 min。

222检测条件及操作过程在样品池中注入被滴定溶液（黄芩水煎液供试品溶液）300 μL，进样针吸入滴定溶液（小檗碱溶液）50 μL，恒温至30 ℃，控制搅拌速率为250 r·min-1，待仪器自动平衡后开始滴定小檗碱溶液，连续滴定20滴，每滴25 μL，间隔时间为180 s。

223数据处理及分析在滴定过程中，ITC Run软件会自动采集每次滴定的热量变化，每滴的热量变化由峰面积积分得到，能量变化值曲线峰朝上代表滴定过程反应放热，能量变化为负值[1213]。将4组滴定所得的能量变化分别取平均值，由于提取条件、滴定条件、稀释倍数完全一致，因此可通过对比平均值来判断不同试验组反应程度的差别，即不同黄芩药材质量的差别。

224滴定试验及结果用25 mmol·L-1小檗碱分别滴定空白去离子水、黄芩A，B，C及黄芩苗供试品溶液，滴定过程的能量变化值，见图1～5，根据数据绘制出的能量变化折线图，见图6，计算出的能量变化平均值，小檗碱溶液滴定黄芩A，B，C及黄芩苗的能量变化依次为：-31720，-29283，-20895，-2153 μJ。由图1～6可知，小檗碱滴定去离子水的过程为稀释吸热过程，小檗碱滴定黄芩水煎液的过程与小檗碱滴定水相比均为明显的放热过程，指示小檗碱与黄芩成分间发生了明确的放热反应，滴定过程的热量变化由高到低依次为：黄芩A、黄芩B、黄芩C、黄芩苗，说明不同批次黄芩中能与小檗碱发生缔合反应的黄酮类化合物（以黄芩苷为主）含量由高到低依次为：黄芩A、黄芩B、黄芩C、黄芩苗。

小檗碱溶液滴定黄芩A，B，C及黄芩苗的能量变化依次为：-31720，-29283，-20895，-2153 μJ。其中，黄芩苗的能量变化显著低于其

23紫外分光光度法测定

231对照品标准溶液的制备称取黄芩苷370 mg，溶于50 mL水中，移入500 mL量瓶并稀释至刻度，摇匀，得黄芩苷溶液作为对照品。

232供试品溶液的制备分别精密量取黄芩A、黄芩B、黄芩C和黄芩苗水煎液300 μL，微孔滤膜滤过，置于500 mL量瓶中，加去离子水定容至刻度，搖匀既得4批药材的供试品溶液。endprint

233对照品及供试品最大吸收波长及吸光度测定量取等量标准品及供试品溶液，以试剂为空白对照，在200～600 nm波长范围内测定对照品及供试品的最大吸收波长及吸光度，黄芩苷（黄色）的最大吸收波长为276 nm，黄芩水煎液供试品的最大吸收波长均为276 nm，最大吸收波长处的吸光度从大到小依次为黄芩苷（0440±0019）、黄芩A（0374±0015）、黄芩B（0333±0012）、黄芩C（0272±0012）、黄芩苗（0124±0008），也即黄芩水煎液中含黄酮类化合物（以黄芩苷为主）含量的梯度顺序，其中黄芩苗的吸光度显著低于其他3组，说明黄芩苗中以黄芩苷为代表的黄酮类化合物含量显著低于其他3组黄芩水煎液，与ITC试验结果相吻合，见图7。

234稳定性试验精密吸取黄芩苷对照品溶液按上述方法操作，在室温下放置2，4，8，12，24 h分别测定吸光度，吸光度依次为0440，0438，0439，0440，0441，RSD为023%。说明溶液24 h内基本稳定，不影响含量测定。

235精密度试验精密吸取黄芩苷对照品溶液，在276 nm波长处测定吸光度，重复测定5次，吸光度依次为0440，0441，0441，0442，0440。计算RSD为017%。说明本试验精密度良好。

3讨论

本试验通过ITC技术和紫外分光光度法分别对4批黄芩药材进行测定，结果表明ITC测定结果与紫外测定的黄酮类化合物含量顺序完全吻合，说明ITC检测小檗碱滴定黄芩水煎液的能量变化幅度可以代表黄芩中黄酮类化合物的含量多少，即在相同滴定条件下，滴定的平均能量值越高，提示黄芩中的能与小檗碱反应的黄酮类化合物含量越高；反之，滴定的平均能量越低，提示黄芩中能与小檗碱反应的黄酮类化合物含量越低。此外，随着黄芩药材批次的改变，ITC测定能量波动幅度明显大于紫外测定吸光度值变化，提示该方法较紫外法具有更高的灵敏度；经证实ITC能用于表征黄芩的质量，基于ITC建立的以一类活性成分为指标评价黄芩药材质量的方法是简便、科学且可行的。

相比传统方法，本试验主要有两点创新。一是引入ITC技术，通过热力学手段测定黄芩中活性成分的含量。二是受启发于中医配伍原理，基于黄芩黄连药对的中医临床使用现状，选用小檗碱作为标准物质。从黄芩黄连水煎液反应有大量沉淀并且沉淀有很好的神经保护活性出发，不再以单一成分的含量多少来评价一个药材的好坏，而是通过一类活性成分的反应强度来判断药材质量，这种中药质量评价的思路是具有创新性的。

本试验的不足在于只对药材质量做了半定量分析，尚需确定小檗碱与黄芩中黄酮类化合物的反应比例，建立相关模型分析，通过标准物质小檗碱的消耗量计算出黄芩中活性成分含量，因此对于药材质量的完全定量分析还需进一步探索。此外，本实验只是初步探究ITC技术表征黄芩质量的可行性，尚缺少应用更多批次药材建立滴定数据库，以便对药材质量做更好的分级评定。

本研究的应用前景十分广泛，对于中药质量的标准化、检测手段的多样化具有深远意义。不但可以用于黄芩质量的评价，还能用于很多具有典型酸碱性中药配伍的质量研究。关于本试验的定量完善以及本思路对其他药物质量研究的进展，将会后续报道。

[参考文献]

[1]张铁军 中药质量认识与质量评价[J]. 中草药， 2011， 42（1）：1.

[2]郭倩， 田成旺， 任涛，等. 中药药效物质基础研究进展[J]. 世界科学技术——中医药现代化， 2015（3）： 648.

[3]刘昌孝， 陈士林， 肖小河， 等. 中药质量标志物（QMarker）：中药产品质量控制的新概念[J]. 中草药， 2016， 47（9）： 1443.

[4]周培培， 言方荣， 张春凤，等. 基于成分群动态变化探索药材质量优劣判断方法初步研究[J]. 中医药学报， 2012， 40（1）：63.

[5]瞿佐发 黄芩的药理作用及临床应用[J]. 时珍国医国药， 2002， 13（5）：316.

[6]潘林梅， 傅佳， 朱华旭， 等. 黄连解毒汤提取动态过程及沉淀产生机制的初步研究[J]. 中国中药杂志， 2010， 35 （1）： 40.

[7]Zhang C Z， Zhao R， Yan W Q， et al Compositions， formation mechanism， and neμroprotective effect of compound precipitation from the traditional Chinese prescription HuangLianJieDuTang[J]. Molecules， 2016， 21（8）： 1094.

[8]宋熙熙 蛋白质表面活性剂相互作用及酶催化反应的量热学研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2008.

[9]鄢丹， 陈龙虎， 冯雪， 等. 基于等温滴定量热技术的清开灵注射液临床联合用药相互作用表征研究[J]. 中草药， 2012， 43（11）： 2217.

[10]Ohtaka H， VelázquezCampoy A， Xie D， et al Overcoming drug resistance in HIV1 chemotherapy： the binding thermodynamics of amprenavir and TMC126 to wildtype and drugresistant mutants of the HIV1 protease[J]. Protein Science， 2002， 11（8）：1908.

[11]Pierce M M， Raman C S， Nall B T Isothermal titration calorimetry of proteinprotein interactions[J]. Methods， 1999， 19（2）：213.

[12]焦銘 过氧化氢酶去折叠及其与超氧化物歧化酶相互作用的研究 [D]. 武汉： 武汉大学， 2003.

[13]刘敏 蛋白质及其模型分子的溶液热力学研究 [D]. 杭州： 浙江大学， 2007

[责任编辑丁广治]endprint