铁皮石斛花多糖相对分子质量及其单糖组成的研究

张四杰　钱正　刘京晶　张新凤　斯金平

[摘要]为了明确铁皮石斛花中多糖相对分子质量分布及其单糖组成，该研究采用高效凝胶色谱和柱前衍生UPLC对11个铁皮石斛花样品的多糖进行了相对分子质量及其单糖组成分析，并利用SPSS 190软件根据组成的单糖峰面积进行聚类分析，结果表明11个杂交家系铁皮石斛花的粗多糖均分离为三部分（DOP1，DOP2和DOP3），其平均相对分子质量分别为553×105，349×105和212×105。铁皮石斛花多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖5种单糖组成，其中甘露糖组成比例最高，其与葡萄糖比值为0302～3335；不同家系样品多糖中各单糖的相对含量存在一定差异，11个家系按单糖组成及相对含量划分为4类，该研究基本明确了铁皮石斛花中多糖相对分子质量分布及单糖构成，为其资源利用打下基础。

[关键词]铁皮石斛花； 多糖； 相对分子质量分布； 单糖组成； 高效凝胶色谱； 超高效液相

[Abstract]In order to provide new information on polysaccharide in Dendrobium officinale flowers，the monosaccharide composition and relative molecular mass distribution of 11 families of flowers were investigated and analyzed by high performance gel filtration chromatography （HPGFC） and precolumn derivatization ultra performance liquid chromatography （UPLC） in this study Then cluster analysis was carried out for the monosaccharide peak areas by utilizing SPSS 190 software The results showed that the polysaccharides of all the above 11 hybrid families of D officinale flower were separated into three fractions （DOP1， DOP2 and DOP3） with the average relative molecular mass of 553×105， 349×105 and 212×105 The polysaccharides in 11 different families were mainly composed of glucose， mannose， galactose， galacturonic acid and arabinose； mannose had the highest proportion among them， with mannose/glucose ratio of 03023335 Additionally， the relative contents of various monosaccharides in different families varied 11 families of D officinale flower could be classified into four categories according to their monosaccharide components and relative contents In this study， the relative molecular mass distribution and monosaccharide composition of polysaccharides in D officinale flowers were defined， which can provide foundations for its resource utilization.

[Key words]Dendrobium officinale flower； polysaccharide； relative molecular mass distribution； monosaccharide composition； HPGFC； UPLC

铁皮石斛Dendrobium officinale Kiumra et Migo属兰科石斛属Dendrobium多年生附生草本植物，以茎入药，具有滋阴清热、益胃生津之功效[1]。在栽培生产中，铁皮石斛花量较大，民间多鲜食或烘干泡茶，应用历史悠久。铁皮石斛花具有舒缓精神紧张、滋阴护肝等功效[2]，主要含有多糖、黄酮碳苷、挥发性成分、氨基酸等主要成分[36]。药典规定铁皮石斛茎的多糖含量不低于2500%，其中葡萄糖与甘露糖比值为24～80，且多糖的活性与其相对分子质量大小，含量和所含单糖组成比例密切相关[79]。铁皮石斛花多糖含量低于茎[10]，但其相对分子质量大小、组成多糖的单糖类型和组成比例与茎是否相同尚不清楚。为了更好地利用铁皮石斛花资源，本实验选取11个杂交家系铁皮石斛花，利用高效凝胶色谱分析多糖的相对分子质量分布，并将粗多糖进行柱前酸水解及衍生，采用UPLC测定多糖中单糖组成，明确铁皮石斛花中多糖的具体相对分子质量分布及单糖组成比例，以期为铁皮石斛花质量评价及资源利用提供理论依据。

1材料

Acquity超高效液相色谱仪（PDA检测器，美国Waters公司）；Agilent1200高效液相色谱系统（RID检测器，美国Agilent公司） ；紫外可見分光光度计（Thermo Scientific GENESYS 10s UVVIS）；DKS24型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；D37520型高速离心机（德国Heraeus公司）；DHG9416A恒温电热鼓风干燥箱；KQ500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ALPHA 12 LD Plus冻干机（北京博劢行仪器有限公司）；AB104N电子分析天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司）。endprint

鼠李糖（批号 111683200401）、D半乳糖醛酸（批号 111646200301）、D葡萄糖（批号 110833200503）、D葡萄糖醛酸（批号 140648200602）、D甘露糖（批号 140651200602）对照品均购于中国食品药品检定研究院；D半乳糖（批号 20120209）、D阿拉伯糖（批号 20120209）、木糖（批号 B21880）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司；1苯基3甲基5吡唑啉酮（PMP）购于国药集团化学试剂有限公司；水为去离子水，乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

供试的11个不同杂交家系铁皮石斛花样品，2016年6月14日采集于浙江省临安市天目山镇横塘村麻泥角弄（东经119°26′11″，北纬30°20′30″，海拔280 m），经浙江农林大学斯金平教授鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛花，经过80 ℃杀青，60 ℃彻底烘干，粉碎，过60目筛备用。其中C13为天目山野生种质，共有3种栽培模式，分别为岩壁附生（C13壁）、梨树附生（C13梨）及盆栽（C13），其他均为智能温室盆栽样品，亲本名称及子代农艺性状见表1，图1。

2方法

21铁皮石斛花总多糖含量测定

211供试品溶液制备

精密称定铁皮石斛花干样0300 0 g，加入蒸馏水200 mL，水浴回流25 h，趁热过滤，定容到250 mL，摇匀静置，取提取液5 mL于50 mL离心管中，加无水乙醇25 mL，4 ℃冷藏1 h，6 000 r·min-1离心1 h，弃上清液，沉淀加80%乙醇20 mL离心30 min，去上清液，最后沉淀加20 mL 80%乙醇離心20 min，弃上清液，沉淀加热水溶解定容至50 mL。精密吸取1 mL提取溶液加1 mL 5%苯酚溶液，最后精密加入5 mL浓硫酸，混匀，冰水中静置5 min，沸水浴20 min，取出冰水中放凉，以1 mL水为空白，于488 nm处测定吸光度，试验平行3次。

212标准曲线制备

精密称取葡萄糖1000 0 mg，定容至10 mL，即配制成01 g·L-1的标准液，然后分别精密吸取01，02，04，06，08，1 mL标准液于试管中，加水补足至1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，混匀，精密加入5 mL浓硫酸，混匀，冰水中静置5 min，沸水浴 20 min，取出冰水中冷却，于488 nm 处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得其回归方程为 Y=12898X+0064 1（R2=0999 8），结果表明葡萄糖质量浓度在0005～005 g·L-1与吸光度呈良好的线性关系。

22铁皮石斛花多糖相对分子质量分布及其质量分数测定

221铁皮石斛花粗多糖提取

称取不同家系铁皮石斛花粉末各0500 0 g，加入10倍体积水，水浴回流提取25 h，过滤，收集滤液，残渣重复煎煮3次，合并滤液，分别离心，合并上清液，浓缩到20 mL，玻璃棒一边搅拌一边缓慢加入80 mL无水乙醇，在4 ℃温度下，醇沉48 h，离心，倒出上清液，将沉淀用丙酮反复洗涤2次，真空冷冻干燥得到铁皮石解花多糖粗品。多糖溶液中1∶5 的比例加入Sevags试剂（正丁醇氯仿 1∶4）混合液，充分摇匀，震荡2 min，溶液成乳浊液，室温下3 000 r·min-1离心20 min，取上清液放入透析袋流水透析72 h，蒸馏水透析24 h后，冷冻干燥，得铁皮石斛花粗多糖。准确称取铁皮石斛花粗多糖1000 0 mg，加入1 mL 双蒸水，配成1 g·L-1水溶液，045 μm滤膜过滤，备用。

222对照品溶液制备

2221多糖相对分子质量测定对照品溶液制备准确称取平均相对分子质量分别为805×105，366×105，200×105，113×105，488×104，217×104，62×103的普兰糖各1000 0 mg，精密加入1 mL双蒸水，配置成每种标样的质量浓度为1 g·L-1，充分摇匀，045 μm滤膜过滤，即得。

2222多糖各分离流分质量分数测定对照品溶液制备准确称取平均相对分子质量为366×105普兰糖对照品，精确至0000 1 g，用流动相配置成质量浓度为5，25，2，1，0625，0312 5，0156 2 g·L-1一系列对照品溶液，045 μm滤膜过滤，即得。

223高效凝胶色谱条件

高效凝胶色谱分析柱为XtimateTM SEC300 （78 mm× 300 mm，5 μm），两柱串联，流动相为双蒸水，进样量10 μL，流速10 mL·min-1，示差折光检测器（RID），柱温35 ℃。

23铁皮石斛花多糖中单糖组成种类测定

231铁皮石斛花多糖完全酸水解和衍生化产物制备

精密吸取21项下多糖溶液1 mL，置于水解管中，加30 mol·L-1的盐酸溶液05 mL，封口，混匀，110 ℃水解1 h，放冷，加30 mol·L-1的氢氧化钠溶液05 mL调pH至中性，备用。吸取上述溶液及配置好的01 g·L-1的单糖对照品溶液各400 μL，加05 mol·L-1PMP甲醇溶液和03 mol·L-1的氢氧化钠溶液各400 μL，混匀，封口，70 ℃水浴100 min；加03 mol·L-1盐酸溶液500 μL，混匀，用三氯甲烷萃取3次，每次2 mL，弃三氯甲烷层，水层离心后过045 μm的微孔滤膜备用。

232色谱条件

ACQUITYBEH C18色谱柱，流动相002 mol·L-1乙酸铵（A）乙腈（B），梯度洗脱（0～7 min，17%B；7～71 min，17%～20%B；71～20 min，20%B；20～201 min，20%～17% B；201～24 min，17%B），柱温35 ℃，检测波长254 nm，进样量3 μL。endprint

233方法学考察

2331精密度试验取同一供试品溶液，在232项下的色谱条件下，重复进样6次，测定的5种单糖的保留时间和峰面积的RSD均小于20%，表明仪器精密度良好。

2332稳定性试验取同一供试品溶液，在232项下的色谱条件下，在0，2，4，8，16，24 h分别进样测定，测得5种单糖的保留时间和峰面积的RSD均小于30%，表明供试样品溶液在24 h内稳定。

2333重复性试验取同一铁皮石斛花样品6份，按21条件下提取，231项条件下水解和衍生化处理，在232项下的色谱条件下测定，测得5种单糖的保留时间和峰面積的RSD均小于20%，表明该方法的重复性良好。

3结果

31铁皮石斛花多糖各流分相对分子质量及其质量分数测定

311不同家系铁皮石斛花总多糖含量

铁皮石斛花作为非药用部位，其总多糖含量低于药典对茎的含量要求（<25%）[11]，通过测定可知，所有杂交家系花中多糖的平均质量分数为6921 mg·g-1，变幅为3943～8856 mg·g-1（40%～90%），变异系数为2646%。3种栽培模式下的样品中，C13岩壁附生的花中多糖质量分数（6772 mg·g-1）明显低于其盆栽和梨树附生花中多糖质量分数（8856，8220 mg·g-1），次生代谢物质积累与环境关系密切[12]，可能是岩壁附生的铁皮石斛受光照强度及温度影响，其次生代谢物质的合成积累较旺盛，消耗较多的养分，导致多糖含量较低。

312铁皮石斛花多糖相对分子质量分布

将配制的不同相对分子质量大小的普兰糖标准溶液经HPGFC分析，以LogMw为纵坐标，保留时间tR为横坐标，得线性回归方程为Y=-0242 3X+7948 5 （R2 =0996）。将221项下制备的不同杂交家系铁皮石斛花多糖溶液在相同色谱条件下进行分析，从图2可看出铁皮石斛花多糖在高效凝胶色谱柱中按相对分子质量大小共分离为3部分，分别为DOP1，DOP2和DOP3，其中DOP1和DOP3峰形较宽，说明这2个流分中多糖成分的相对分子质量分布范围较大；而DOP2峰形较窄，且为单一对称峰，说明DOP2中的多糖相对分子质量分布相对集中，为均一分布。根据线性回归方程计算各杂交家系花中多糖相对分子质量大小，从表2可知，DOP1，DOP2和DOP3平均相对分子质量为553×105，349×105和212×105，说明铁皮石斛花中的多糖多为相对分子质量较大的多糖。另外，铁皮石斛花多糖相对分子质量分布在11个杂交家系中差异较大，DOP1相对分子质量变幅为505×105～631×105，DOP2相对分子质量变幅为300×105～443×105，DOP3相对分子质量变幅为173×105～247×105。铁皮石斛多糖的合成和积累受生长时间和环境影响较大，在植物不同部位中分布及组成也不同。张勇等采用高效凝胶色谱法测得铁皮石斛茎和花中多糖相对分子质量分布均为2部分，但平均相对分子质量差别较大，茎为206×105和15×104，花为351×105和36×104[13]。本实验测得花中多糖主要由3部分组成，可能是由于铁皮石斛原料和提取纯化的方法不同，所得到的铁皮石斛花多糖相对分子质量个数及大小也不同[1415]。

313DOP1，DOP2和DOP3质量分数

选择相对分子质量为366×105普兰糖对照品，将凝胶色谱峰面积与标准溶液的质量浓度进行线性回归，得线性方程为Y=82 428X+5 2082，r=0999 1，多糖质量浓度在0156 25～5 g·L-1呈现良好的线性关系，色谱图见图3。根据回归方程计算得出不同杂交家系铁皮石斛花多糖DOP1，DOP2和DOP3相对于粗多糖的质量分数，见表2。各样品间多糖DOP1，DOP2，DOP3质量分数差异较大，其中DOP1占有比例最大，平均质量分数为3419%，显著高于DOP2（1572%）和DOP3（1983%）。

32铁皮石斛花多糖中单糖组成种类及其比例分析

将231项下制备液经UPLC色谱分析，结果见图4。通过对11个铁皮石斛花样品多糖酸水解后的衍生化产物的指纹图谱和生成的对照谱图进行分析，确定5个主要共有峰，即铁皮石斛花多糖中的主要单糖组成为甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。通过比较对照品和样品谱图，在样品中未能检测到鼠李糖、木糖和葡萄糖醛酸，与茎中多糖中的单糖组成相比较，铁皮石斛花多糖中未检测到木糖[16]，但含有相同的甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖这5种成分。

在中药指纹图谱中一般选择含量比较高并且稳

定的峰作为参照峰，在铁皮石斛花多糖中5种单糖中，葡萄糖的含量较高且比较稳定，因此选择葡萄糖为参照峰，计算其他4种单糖相对峰面积，见表3。11个不同家系铁皮石斛花多糖中各单糖的组成比例存在一定差异，其中甘露糖所占比例最大，其相对峰面积变幅为0302～3335，变异系数为4948%；半乳糖醛酸相对峰面积变幅为0116～1243，变异系数为5893%；半乳糖相对峰面积变幅为0239～1076，变异系数为5196%；阿拉伯糖相对峰面积变幅为0395～1845，变异系数为6658%；4种单糖的相对峰面积变异系数由大到小为阿拉伯糖>半乳糖醛酸>半乳糖>甘露糖。结果表明甘露糖相对峰面积变异系数最小，其相对峰面积贡献率最大，阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸相对峰面积贡献率较小。

3311个杂交家系铁皮石斛花聚类分析

选取铁皮石斛花多糖中指标性单糖组分，采用SPSS190软件利用欧氏距离、离差平方和法进行聚类分析，以10（15）间距为轴，可将11个铁皮石斛花家系聚为四大类，见图5。其中，6A2B和C13 2个家系的半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的峰面积较为接近，聚为一类，另外2个家系茎均较粗，花瓣心浅黄色，说明外观性状和成分组成具有相似性；endprint

1甘露糖；2.鼠李糖；3.葡萄糖醛酸；4.半乳糖醛酸；5.葡萄糖 ；6.半乳糖；7.阿拉伯糖；8.木糖。

5×163，9×163，13×163，5×168，78×69和C13梨树附生6个家系甘露糖、半乳糖醛酸和半乳糖峰面积较为接近，归为一类；13×168和17×163半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖峰面积较为接近，聚为一类；C13岩壁栽培样品五种单糖峰面积较为接近，单独聚为一类。从聚类结果来看，遗传因素和栽培环境是决定铁皮石斛花外观及成分组成的关键因素：以亲本163为父本的杂交家系5种单糖组成比例差异较大，并未聚为一类，说明物质积累受另一亲本遗传因素的影响较大；3种栽培环境下的C13品系单糖组成比例显著不同。

4讨论

本文通过高效凝胶色谱测得铁皮石斛花多糖由三部分组成（DOP1，DOP2和DOP3），平均相对分子质量为553×105，349×105和212×105，且均为相对分子质量较大的多糖，其中DOP1占总多糖比例最大。不同家系铁皮石斛花多糖中单糖组成种类基本相同，主要包括半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，各单糖组成比例不同，甘露糖和葡萄糖在多糖中分布较多，尤其甘露糖贡献率最大。2015年版《中国药典》中规定，铁皮石斛茎多糖中甘露糖与葡萄糖峰面积比为24～80，本实验中9×163，78×69花多糖中甘露糖与葡萄糖比值在此范围之内，说明多糖合成和积累在不同部位中具有相似性。不同家系铁皮石斛花总多糖含量及各单糖组成比例也均存在一定差异，通过聚类分析，形成亲缘关系较为接近的4类，每一类亲缘关系较近的家系在单糖组成比例上较为接近，且花色与花形态较为接近。本实验结果明确了不同家系铁皮石斛花多糖相对分子质量大小与含量，以及多糖的单糖组成种类和组成比例，为铁皮石斛的资源利用及品种选育提供理论基础。

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[责任编辑孔晶晶]endprint