不同紫花苜蓿品种对低磷环境的形态与生理响应分析

栗振义，张绮芯，仝宗永，李跃，徐洪雨，万修福，毕舒贻，曹婧，何峰，万里强，李向林



不同紫花苜蓿品种对低磷环境的形态与生理响应分析

栗振义1，张绮芯2，仝宗永1，李跃1，徐洪雨1，万修福1，毕舒贻1，曹婧1，何峰1，万里强1，李向林1

（1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2兰州大学草地农业科技学院/草地农业生态系统国家重点实验室，兰州 730020）

筛选耐低磷苜蓿品种及与耐低磷密切相关的性状指标，进一步为紫花苜蓿耐低磷机制研究和生产应用提供理论依据。在溶液培养条件下，对20个紫花苜蓿品种的24 d龄的幼苗分别进行常磷（500 μmol·L﹣1KH2PO4）和低磷（5 μmol·L﹣1KH2PO4）处理，30 d后检测各品种的茎叶干重（）、株高（）、根干重（）、根冠比（）、总根长（）、根表面积（）、全磷含量（）、磷利用率（）、酸性磷酸酶活性（），并计算各指标的耐低磷系数。进一步对各指标的耐低磷系数进行相关性分析，并运用主成分分析、隶属函数分析、回归分析及聚类分析方法，综合评价不同品种耐低磷性及筛选与耐低磷密切相关的指标，同时建立耐低磷评价模型。低磷胁迫下，各品种紫花苜蓿的地上部分生长受到抑制，地下根系增大，全磷含量显著下降（＜0.01）。通过主成分分析可将9个单项指标转化为4个新的相互独立的综合指标。进一步利用隶属函数对4个新的综合指标进行耐低磷综合评价，结合聚类分析结果，可将20个紫花苜蓿品种可分为三类，其中耐低磷较强的品种包括敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠；中度耐低磷品种包括骑士T、驯鹿、牧歌37CR、龙牧801等9个品种；耐低磷较弱的品种包括巨能Ⅱ、中苜2号、康赛等7个品种。进一步利用逐步回归分析方法建立了紫花苜蓿耐低磷性评价数学模型=-0.7997+0.3856+0.2025+0.3789+0.1051+0.4188+0.1347，方程的决定系数R=0.9982.通过分析紫花苜蓿不同品种的耐低磷能力，得出耐低磷较强的品种为敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠，与耐低磷性最相关的指标有茎叶干重、株高、根干重、总根长、全磷含量和酸性磷酸酶活性，可用于紫花苜蓿耐低磷性的评价筛选。

紫花苜蓿；耐低磷；主成分分析；综合评价；回归分析

0 引言

【研究意义】据统计当今世界13.19亿hm2耕地中约有43%的土壤缺磷，中国1.07亿hm2农田中约有50%的耕地土壤速效磷含量低于5 mg·kg-1[1]，而紫花苜蓿生产所需有效磷一般为10—15 mg·kg-1[2]。磷属于非可再生资源，磷矿资源预计还可以利用50－200年[3]，依靠施用大量磷肥难以满足未来农业生产的需求，而且中国磷肥的当季利用率只有15%左右，总利用率也不超过25%[4]，有效磷极易与金属离子及土壤颗粒形成AlPO4、FePO4、Fe3(PO4)2、Ca3(PO4)2等难溶磷[5-6]。所以提高紫花苜蓿（）磷吸收利用效率，改善磷营养遗传特性是解决土壤有效磷缺乏的有效途径。通过挖掘紫花苜蓿自身遗传潜力，筛选耐低磷品种，可以为苜蓿磷高效吸收利用机制的研究提供理论依据。【前人研究进展】磷是植物生长所必需的大量元素之一，是构成核酸、磷脂、高能磷酸化合物等的重要组分，并参与能量代谢、糖分代谢、酶促反应、光合作用等重要代谢过程[7]。磷高效植物在磷素营养供应不足时仍能维持正常生长或受低磷影响较小，如磷高效大豆表现为磷吸收能力强，再分配效率高，低磷条件下保持较多的磷，因此表现为耐低磷[8]。耐低磷植物主要通过调整根形态结构、分泌有机酸和磷酸酶、结合丛植菌根真菌、诱导高亲和磷转运蛋白[9]等措施提高土壤磷的吸收效率[10]，同时通过释放液泡中磷，改造膜减少对磷脂的依赖，转移衰老组织中的磷等方式提高磷利用效率以维持体内磷浓度的平衡[3]。根系作为植物营养吸收器官，在低磷胁迫下通过增加根冠比、促进侧根和根毛的生长扩大吸收磷面积[11]。其中最典型的是白羽扇豆（）在低磷下形成排根，大大提高了磷吸收效率[12]。低磷下植物根系通过分泌磷酸酶催化磷酸单酯水释放磷[13]，以及释放柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸等多种有机酸活化土壤中的Al、Fe、Ca等形成的难溶性磷酸盐[14-15]。目前已有多篇文章报道了大豆（）耐低磷品种的筛选与评价[16-18]，但关于紫花苜蓿耐低磷评价及机制研究较少。高艳等[19]指出黄花苜蓿（）主要通过根系分泌柠檬酸活化根际难溶磷，而蒺藜苜蓿通过维持较大的根系来适应低磷环境。任立飞[20]发现低磷胁迫下锡盟黄花苜蓿的干重、鲜重、株高、地上部磷含量、净光合速率、气孔导度与蒸腾速率等下降幅度较小，而主根长与柠檬酸释放速率的增加幅度较大，综合评价得出锡盟黄花苜蓿的耐低磷性强于呼盟黄花苜蓿。【本研究切入点】解决土壤有效磷缺乏问题只能从增施磷肥或改变植物磷吸收效率两方面入手，但施入土壤的磷肥很容易被固定并造成磷资源浪费，所以挖掘植物遗传潜力，筛选耐低磷紫花苜蓿品种是解决土壤有效磷缺乏的有效途径。【拟解决的关键问题】本研究通过模拟低磷环境，分析20个紫花苜蓿品种幼苗期耐低磷综合表现，并基于各形态生理指标与耐低磷性的关系建立苜蓿耐低磷评价模型，以期筛选出耐低磷较强的紫花苜蓿品种以及与耐低磷密切相关的指标，为紫花苜蓿耐低磷评价及磷高效吸收利用机制研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试紫花苜蓿材料

参试材料为20个国内外紫花苜蓿品种，品种名见表1。

表1 试验材料

1.2 培养条件

挑选颗粒饱满颜色纯正的紫花苜蓿种子，用75%酒精灭菌后晾干，置于含有滤纸的培养皿发芽。保持湿润条件，待幼苗生长9 d时移至36 cm×26 cm×14 cm的含有营养液的方形培养盆，置于温室培养。每盆移植60棵，温室条件为昼/夜温度为25℃/20℃，湿度为60%，光照/黑暗为14 h/10 h，每4 d换一次营养液，营养液pH 6.0－6.3。营养液成分为1 000 μmol·L-1MgSO4，250 μmol·L-1K2SO4，250 μmol·L-1CaCl2，1 000 μmol·L-1NH4NO3，2 500 μmol·L-1KNO3，500 μmol·L-1KH2PO4，100 μmol·L-1Fe-Na2-EDTA，30 μmol·L-1H3BO3， 5 μmol·L-1MnSO4，1 μmol·L-1ZnSO4，1 μmol·L-1CuSO4，0.7 μmol·L-1Na2MoO4。紫花苜蓿幼苗在正常磷（500 μmol·L-1KH2PO4）条件下生长15 d后，进行低磷（5 μmol·L-1KH2PO4）胁迫，以常磷条件为对照，连续胁迫处理30 d后分别检测低磷与常磷条件下紫花苜蓿低磷相关性状指标，每个指标检测3个生物学重复，每个重复4个单株。

1.3 性状测定

取低磷条件下培养30 d的紫花苜蓿幼苗，以常磷培养为对照，3组重复，每组取4株生长均一的植株，测量株高；取紫花苜蓿根及茎叶，100℃杀青30 min后60℃烘烤48 h，分别称量茎叶及根干重，并计算根冠比；用根系扫描仪扫描完整的根系并利用万深LA-S根系分析系统计算总根长及根表面积。

酸性磷酸酶活性检测：称取0.1—0.3 g新鲜根，尽量取根尖部分，液氮条件下研磨至粉末状，溶于1.2 mL的0.1 mol·L-1提取缓冲液（1 mol·L-1冰醋酸溶液8.82 mL和0.3 mol·L-1醋酸钠溶液273.3 mL，pH 4.0），酸性磷酸酶活性以单位时间内单位鲜重质量的紫花苜蓿根内酸性磷酸酶水解对硝基苯磷酸二钠（ρ-NPP）生成对硝基苯酚（ρ-NP）的量（μmol·g-1·h-1）表示[17]。

植株地上部分磷含量的测定：植株茎叶在100℃杀青30 min后于60℃烘烤48 h至恒重，采用钼锑抗比色法测定植株磷含量[21]，并计算磷利用率[17]，植株磷利用率=植株干重/植株磷吸收量。

1.4 数据统计分析

利用SAS 9.2进行相关性分析、主成分分析、聚类分析、逐步回归分析，采用隶属函数对20个品种的紫花苜蓿进行耐低磷综合评价。指标计算参考相关文献[22-23]。

分别计算茎叶干重、株高、根干重、根冠比、总根长、根表面积、酸性磷酸酶活性、植株全磷含量及植株磷利用率的耐低磷系数[17]。

不同品种紫花苜蓿综合指标的隶属函数值计算：

式中，(X)表示第个综合指标的隶属函数值，X表示第个综合指标值；X表示第个综合指标的最大值，X表示第个综合指标的最小值。

各综合指标权重的计算：

W==1, 2, 3, …, n（3）

式中，W表示第个综合指标在所有综合指标中的重要程度及权重；P为各品种第个综合指标的贡献率。

耐低磷综合评价值的计算：

=1, 2, 3, …, n（4）

式中，表示在低磷胁迫条件下各品种耐低磷能力的综合评价值。

2 结果

2.1 低磷下各性状差异分析

紫花苜蓿幼苗在常磷与低磷胁迫下各性状都存在差异。为了消除品种间固有的差异，采用了耐低磷系数（即相对值）计算方法，以便准确地反映不同品种的耐低磷性。如表2所示，紫花苜蓿茎叶干重的耐低磷系数变化范围在0.5930—1.0756，有17个品种小于1，株高的耐低磷系数变化范围为0.6454— 1.1828，其中18个品种小于1，综合表明，低磷导致茎叶干物质量及株高下降；根干重和根冠比耐低磷系数分别为0.6429—1.6120和1.0805—1.5648，表明低磷导致根系比例增大；总根长和根表面积耐低磷系数变化范围分别为0.6455—1.3110和0.6480— 1.3129，其中敖汉、耐盐之星、皇冠、驯鹿、甘农3号总根长及根表面积的耐低磷系数均大于1，有报道显示紫花苜蓿通过增大根系来适应低磷环境[19]；全磷含量的耐低磷系均小于1，在0.2442—0.4471，说明低磷下全磷含量均低于常磷下的紫花苜蓿，但磷利用率的耐低磷系数均大于1，变化范围为2.2462—4.1289；酸性磷酸酶活性的耐低磷系数变化范围为0.5282—1.5567。

表2 低磷胁迫下不同品种各性状的耐低磷系数

：茎叶干重 Weight of stems and leaves；：株高 Plant height；：根干重 Dry weight of root；：根冠比 Ratio of root to stem；：总根长 Total root length；：根表面积 Root square area；：全磷含量 Total Pi content；：磷利用率phosphate utilization efficiency；：酸性磷酸酶活性Acid phosphatase activity

2.2 性状相关性分析

通过分析不同性状之间的相关性可以揭示性状间是否存在依存关系及相关关系的方向与强度[24]。结果显示部分指标间存在一定相关性，即不同性状间可能存在信息重叠，单靠单项性状难以对表现复杂的耐低磷性进行综合评价。如表3，茎叶干重与株高、根干重、根表面积、酸性磷酸酶活性呈正相关（＜0.05）；根冠比与总根长、全磷含量呈极显著正相关（＜0.01），与酸性磷酸酶活性呈显著负相关（＜0.05）；总根长与根冠比、根干重、株高、根表面积都呈极显著正相关（＜0.01）。全磷含量与磷利用率成极显著负相关（＜0.01），相关系数为-0.9536，全磷含量与根冠比的相关系数为0.5529，呈显著正相关（＜0.05）；酸性磷酸酶活性与茎叶干重呈显著正相关（＜0.05），与根冠比呈显著负相关（＜0.05）。

表3 低磷胁迫下各性状的耐低磷系数相关性

*代表显著性差异（＜0.05），**代表极显著性差异（＜0.01）

* represents significant difference at＜0.05, ** represents significant difference at＜0.01

2.3 主成分分析

主成分分析可在损失较少信息的基础上将大量指标转化为有效少量指标，从而达到简化指标及浓缩数据的目的[22]。由表4—5可知，前4个主成分的贡献率分别为42.17%、25.78%、17.27%、6.82%，其中第1主成分的特征值是3.7950，贡献率为42.17%，对应较大的特征向量是根干重和总根长，反映了根系因子；第2主成分特征值是2.3202，贡献率为25.78%，载荷较高的是茎叶干重；第3主成分特征值为1.5542，贡献率为17.27%，载荷较高的是全磷含量和酸性磷酸酶活性；第4主成分特征值为0.6134，贡献率为6.82%，载荷较高的是株高；前4个主成分累计贡献率达92.04%，其余贡献率可忽略不计，这样可以将9个单项指标转化为4个相互独立的综合指标，并代表了原始指标的大部分信息。

2.4 品种综合评价

2.4.1隶属函数分析 根据主成分分析得到的4个相互独立的综合指标，利用公式（2）计算不同品种各综合指标的隶属函数值(X)。从表6可以看出，在同一综合指标()中，敖汉的(X)最大，为1.0000，巨能Ⅱ的(X)最小，为0.0000，表明敖汉在()综合指标上耐低磷性最强，巨能II耐低磷性最差。根据各综合指标贡献率，利用公式（3）计算其权重W，计算得到4个综合指标的权重分别为0.4582、0.2801、0.1876、0.0741（表6）。进一步利用公式（4）计算耐低磷综合评价值值，并根据值大小对其耐低磷性强弱排序，其中耐低磷较强的有敖汉、新牧1号、耐盐之星等；耐低磷较弱的品种有巨能Ⅱ、中苜2号、康赛等（表6）。

表4 各综合指标特征根及贡献率

表5 各因子载荷矩阵

2.4.2 耐低磷品种聚类分析 为了客观地将不同耐低磷紫花苜蓿分类，对4个新的综合指标的耐低磷评价值采用最大距离法进行了聚类分析[22,25]，根据最大距离值大于1.2050可将20个紫花苜蓿品种分为3类，第一类为耐低磷较强的品种，耐低磷综合评价值为0.6534—0.7352，包括敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠；第二类为中度耐低磷品种，耐低磷综合评价值为0.4404—0.6534，包括骑士T、驯鹿、牧歌37CR、龙牧801、MF4020、三得利、中苜1号、WL232HQ、陇东；第三类为耐低磷较弱的品种，耐低磷综合评价值为0.1733—0.4404，包括WL168HQ、甘农3号、牧歌、公农2号、康赛、中苜2号、巨能Ⅱ（图1）。

2.5 回归模型的建立

为了检验主成分分析结果，同时建立紫花苜蓿耐低磷评价数学模型[22]，本试验以耐低磷综合评价值（）为因变量，以各单项指标的耐低磷系数作自变量进行逐步回归分析[25]，得到回归方程：=-0.7997+ 0.3856+0.2025+0.3789+0.1051+ 0.4188+0.1347（＜0.01），方程的决定系数R=0.9982，=1211.37。由方程可知，在9个指标中有6个指标对紫花苜蓿耐低磷性有显著影响，分别是茎叶干重、根干重、株高、总根长、全磷含量、酸性磷酸酶活性，与主成分分析结果相吻合。对20个紫花苜蓿品种的耐低磷性的综合评价值与预测值进行相关性分析发现，相关系数为=0.92674，达到极显著水平（＜0.01），说明此方程对紫花苜蓿耐低磷性预测效果较好。

表6 各品种的综合性状指标值、权重、μ(X)及综合评价值（D）

3 讨论

土壤对磷具有强烈吸附作用，通常有效磷含量为0.1—10.0 μmol·L-1 [26]，目前已报道了低磷（有效磷浓度≤10 μmol·L-1）对紫花苜蓿形态生理方面的影响[15,19-20]。在室内试验营养液培养环境中，一般将500 μmol·L-1KH2PO4作为苜蓿[19-20]和大豆[27-28]正常磷水平，所以本试验以常磷500 μmol·L-1KH2PO4为对照，在低磷（5 μmol·L-1KH2PO4）环境下对国内外20个紫花苜蓿品种进行了耐低磷评价与分析。植物耐低磷表现是一个复杂的过程，同时受遗传背景和环境因素影响，运用多个指标综合评价才能有效反映出不同品种的耐低磷性。本试验为了消除品种间固有的差异，本试验引用了耐低磷系数进行分析。

低磷胁迫下植物净光合速率、气孔导度与蒸腾速率均下降，从而引起地上生物量减少[29-30]，磷含量降低[20]，根冠比[31]、根系表面积、总根长、磷利用率增大，根尖酸性磷酸酶活性增强[17,20,32]等现象。低磷胁迫下，叶片光合作用下降[33]，叶肉细胞变小[34]，叶面积、叶片生长速率和叶片数量显著减少，从而降低了同化面积并严重限制光合作用的总碳固定量[35]。光合作用的下降主要因为有机磷循环以及RuBP（核酮糖二磷酸羧化酶）更新速率的降低，进而导致植物叶片RuBP浓度、RuBP羧化酶活性、RuBP羧化酶结合位点都有不同程度的降低[36-37]。为了适应低磷环境，植物优先将光合产物分配到地下部分，并抑制地上部分生长[11]，表现为根冠比增加[32,38-39]。本试验中，低磷胁迫下大部分紫花苜蓿品种的茎叶干重、株高有所下降，所有品种表现为全磷含量下降，根冠比和磷利用率增加。

低磷下植物根系分泌酸性磷酸酶也是植物适应低磷胁迫的重要机理[32]，酸性磷酸酶能酶促土壤有机磷化合物的酯磷键发生裂解，释放相应的醇和无机磷，从而提高土壤磷素的有效性[40]。高彬等[41]指出大豆缺磷时根系磷含量降低，但根系组织酸性磷酸酶活性是全磷培养植株的1.3倍。刘渊[17]发现大豆在2 μmol·L-1和1 000 μmol·L-1处理下22个品种根尖酸性磷酸酶的耐低磷系数为1.9229—35.2011。在本试验中，低磷胁迫下部分品种根组织的酸性磷酸酶活性有所增强。

关于植物耐低磷的形态及生理指标有很多，本试验初步选取了9个指标用于紫花苜蓿耐低磷评价。通过主成分分析可将9个原始的单项指标转换成4个新的相对独立的综合指标，进一步对4个新的综合指标利用隶属函数分析法得到耐低磷综合评价值，这样比较客观的展示了不同品种的耐低磷性，避免了利用单个性状指标描述耐低磷的局限性。聚类分析可以根据研究对象之间亲疏关系的统计量进行分类，从而排除人为确定标准带来的主观影响，该方法已普遍应用于植物抗逆材料的筛选研究[22,24-25]，通过聚类可将20个紫花苜蓿品种客观地分为耐低磷品种、中度耐低磷品种、耐低磷较弱的品种。逐步回归得到6个显著影响耐低磷的单项指标，与主成分分析结果一致，同时得到紫花苜蓿耐低磷性评价数学模型，可以预测不同紫花苜蓿品种耐低磷性的强弱，使抗逆性的鉴定与利用研究更有预见性[23]。

4 结论

本研究对20个紫花苜蓿品种进行了耐低磷评价及筛选，根据耐低磷能力强弱可分为3类，其中耐低磷品种包括敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠，中度耐低磷品种包括骑士T、驯鹿、牧歌37CR、龙牧801、MF4020、三得利、中苜1号、WL232HQ、陇东，耐低磷较弱的品种包括WL168HQ、甘农3号、牧歌、公农2号、康赛、中苜2号、巨能Ⅱ。低磷胁迫下，茎叶干重、株高、根干重、总根长、全磷含量、酸性磷酸酶活性可作为筛选耐低磷紫花苜蓿的参考指标。本试验为进一步研究紫花苜蓿磷高效吸收利用机制提供了理论依据。

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（责任编辑 杨鑫浩）

Analysis of Morphological and Physiological Responses to Low Pi Stress in Different Alfalfas

LI ZhenYi1, ZHANG QiXin2, Tong ZongYong1, Li Yue1, XU HongYu1, WAN XiuFu1, BI ShuYi1, CAO Jing1, He Feng1, WAN LiQiang1, LI XiangLin1

(1Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2College of Pastoral Agriculture Science and Technology/State Key Laboratory of Grassland Agro-Ecosystems, Lanzhou 730020)

The objective of this study is to screen low Pi (inorganic phosphate) tolerant alfalfa and related characters, and to provide the theoretical basis for deficient Pi tolerance mechanism and then for application in production.In the condition of nutrient solution, twenty 24-day-old alfalfa seedlings were cultured in nutrient solution with sufficient phosphate (500 μmol·L﹣1KH2PO4) and deficient phosphate (5 μmol·L﹣1KH2PO4). After 30 days of treatment, a variety of physiological indexes, including dry weight of stems and leaves (), plant height (), dry weight of root (), ratio of root to shoot (), total root length (), root square area (), total Pi content (), phosphate utilization efficiency (), acid phosphatase activity (), were measured, and coefficients of resistance to deficient-Pi of each index were calculated. Furthermore, the correlation was carried out on the deficient-Pi coefficient of each index. Based on principal component analysis, subordinate function analysis, regression analysis and cluster analysis, deficient-Pi tolerance of different varieties were evaluated, and the indexes closely related to deficient-Pi tolerance were screened. At the same time, the evaluation model of deficient-Pi tolerance was established.Under deficient-Pi stress, the aboveground growth of all varieties were inhibited. However, the root system and the content of total Pi were decreased (＜0.01). Through principal component analysis, nine primary indexes could be transformed into four new mutual independent comprehensive indexes, which covered 92.04% of information. Then four new indexes were used to comprehensively assess the characters of deficient-Pi tolerance by subordinate function analysis. Combined with the clusters result, 20 alfalfa varieties were divided into three clusters. The varieties resistant to deficient-Pi include Aohan, Xinmu NO.1, Magnum Salt, Phabulous; varieties moderate resistant to deficient-Piinclude nine varieties, such as Knight T, Caribou, Amerigraze 37CR, Longmu 801 and so on; varieties sensitive to deficient-Pi include seven varieties, such as Magnum II, Zhongmu NO. 2, Concept and so on. Furthermore, the mathematic evaluation model of resistance to deficient-Pi,=﹣0.7997+0.3856+0.2025+0.3789+0.1051+0.4188+0.1347(R= 0.9982).The analysis of the ability of deficient-Pi tolerance in different alfalfa varieties showed Aohan, Xinmu NO.1, Magnum Salt and Phabulous have strong resistance to deficient-Pi stress. And the dry weight of stems and leaves, plant height, root dry weight, total root length, total Pi content and acid phosphatase activity were the most suitable indicators for the tolerance to deficient-Pi.

; deficient-Pi tolerance; principal component analysis; comprehensive evolution；regression analysis

2017-02-23；接受日期：2017-06-27

国家牧草产业技术体系（CARS-35）、农业科技创新工程（ASTIP-IAS14）

栗振义，E-mail：lizhenyily@163.com。张绮芯，E-mail：584271141@qq.com。栗振义和张绮芯为同等贡献作者。通信作者李向林，E-mail：lxl@caas.cn