雪松松针挥发油化学成分及抗氧化活性研究

胡文杰 罗 辉 邹林海 李冠喜

(1.井冈山大学生命科学学院，吉安 343009； 2.井冈山大学医学院，吉安 343000； 3.曲阜师范大学生命科学学院，曲阜 273165)

雪松松针挥发油化学成分及抗氧化活性研究

胡文杰1罗 辉2邹林海1李冠喜3*

(1.井冈山大学生命科学学院，吉安 343009；2.井冈山大学医学院，吉安 343000；3.曲阜师范大学生命科学学院，曲阜 273165)

采用水蒸气蒸馏法提取雪松松针挥发油，利用气相色谱-质谱联用技术分析其化学成分。使用维生素C为阳性对照，以DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基清除作用为指标评价挥发油的抗氧化活性。从雪松松针挥发油中鉴定了37种化学成分，占挥发油总量的95.10%，以烃类和醇类为主；挥发油对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基有明显的清除作用，其IC50分别为0.30、0.22及0.96 μg·mL-1，且呈现一定的量效关系。可见,雪松松针挥发油中含有多种有应用价值的化学成分，具有显著的抗氧化活性。

雪松；挥发油；化学成分；气相色谱—质谱联用仪；抗氧化活性

雪松(Cedrusdeodara(Roxb.)G.Don)是松科(Pianaceae)雪松属(CedrusTrew)树种的泛称，包括雪松(C.deodara)、黎巴嫩雪松(C.libani)、短叶雪松(C.brevifolia)和北非雪松(C.atlantica)，该植物原产于喜马拉雅山西部自阿富汗至印度海拔1 300～3 300 m，中国自1920年起引种，现在长江流域各大城市中广泛栽培[1]。雪松松针含有萜类、苯丙素类、黄酮类、酚酸类以及甾体类化合物等[2～4]，富含儿茶素、没食子酸和原儿茶酸等多酚类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等作用[5～7]。目前有关雪松的研究主要集中于化学成分的提取、分析、化感和抑菌等方面，但其挥发油的抗氧化活性研究未见报道，本研究采用水蒸气蒸馏法提取雪松松针挥发油，运用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)分析其化学成分，并以DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的清除作用为指标评价雪松松针挥发油的抗氧化活性，为雪松松针资源的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

样品于2015年3月采自吉安；Perkinelmer-Clarus 680型气相色谱—质谱联用仪(美国Perkin Elmer公司)；1，1-二苯基苦基苯肼[DPPH，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司]；2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)-二氨盐(ABTS)，上海华蓝化学科技有限公司；C8-C40正构烷烃(上海西域科技有限公司)；无水硫酸钠等均为国产分析纯。

1.2 雪松松针挥发油的提取

称取新鲜雪松松针样品400 g，放入圆底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，采用水蒸气蒸馏法提取4 h，收集精油，用无水硫酸钠干燥，得到淡黄绿色透明液体。共提取5组样品，取平均值，雪松松针出油率为0.39%。

1.3 雪松松针挥发油的气相色谱—质谱分析

色谱条件:Elite-5 MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；高纯氦气为载气；体积流量为1 mL·min-1；分流比为：20∶1；程序升温初始温度为50℃，以3℃·min-1升至140℃，保持5 min，以10 ℃·min-1升至260℃，保持10 min；进样量为0.5 μL。质谱条件：电子轰击(EI)离子源，离子源温度230℃，电子能量70 eV，扫描质量范围50～620 amu。

1.4 保留指数RI值的测定

取正构烷烃混合对照品，按照1.3实验条件下分析，记录每个正构烷烃出峰的保留时间，采用保留指数的线性升温公式计算各组分的RI值：

RI=100n+[100(tx-tn)]/[(tn+1-tn)]

(1)

式中：tx、tn和tn+1(tn

1.5 雪松松针挥发油的抗氧化活性测定1.5.1 对DPPH自由基清除的测定方法

用95%乙醇将雪松松针挥发油配制成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 μg·mL-1的溶液，取0.5 mL样品溶液和2 mL浓度为24 mmol·L-1的DPPH乙醇(95%)溶液混合，在黑暗中静置30 min，于波长517 nm处测吸光度(A)，以乙醇为空白对照，测定对照组吸光度(A0)；以VC为阳性对照，最后根据下列公式计算各浓度溶液对DPPH自由基的清除率：

清除率=(1-A/A0)×100%

(2)

上述试验均重复3次，结果取平均值。

1.5.2 对ABTS自由基清除的测定方法

将相同体积的7 mmol·L-1ABTS·溶液与2.45 mmol·L-1过K2S2O8混匀，黑暗处理12～16 h，形成稳定溶液。取适量上述溶液加水，调节溶液使其在734 nm处的吸光度为0.700±0.02。将0.5 mL不同浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 μg·mL-1的雪松松针挥发油溶液混合2 mL的ABTS·溶液，在室温下反应6 min，测定734 nm处的吸光度；以VC为阳性对照，ABTS·清除率的计算公式如下：

清除率=(1-A1/A0)×100%

(3)

式中：A0为不加雪松松针挥发油溶液的ABTS·溶液的吸光度；A1为加雪松松针挥发油溶液后的ABTS·吸光度。

上述试验均重复3次，结果取平均值。

1.5.3 对羟基自由基清除的测定方法

分别取不同浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 μg·mL-1的雪松松针挥发油溶液1 mL，在体系中分别加入6 mmol·L-1的FeSO4溶液1 mL，6 mmol·L-1的水杨酸—乙醇溶液1 mL，6 mmol·L-1的H2O2溶液1 mL，定容至10 mL。在37℃恒温下反应30 min，在510 nm处测定吸光度(A)，以蒸溜水为空白对照，于510 nm处测定吸光度(A0)，以VC为阳性对照，羟基自由基清除率的计算公式如下：

清除率=(1-A1/A0)×100%

(4)

上述试验均重复3次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 雪松松针挥发油化学成分

雪松松针挥发油化学成分GC-MS分析的总离子流图见图1，采用峰面积归一化法估算各组分相对含量，对总离子流图中各色谱峰计算其RI值(表1)。从雪松松针挥发油中共鉴定出37种化学成分，占挥发油总量的95.10%。

表1 雪松松针挥发油成分及其相对含量

图1 雪松松针挥发油总离子流色谱图Fig.1 TLC of volatile oil in tubers from pine needles of C.deodara

Table2ComponentsandtotalrelativecontentsofvolatileoilsfromthepineneedlesofC.deodara

化学成分种类Chemicalspecies烯烃类Olefinhydrocarbon醇类Alcohols酮类化合物Ketones醛类化合物Aldehydes酯类化合物Esters氧化物类Oxidescervidaes相对百分含量Relativecontent(%)90．284．240．220．020．240．10

由表1～2可知，雪松松针挥发油化学成分比较复杂，含有烃类、醇类、酮类、醛类、酯类及氧化物类等，以烃类和醇类化合物为主。挥发油中烃类化合物20种(90.28%)，即α-蒎烯、莰烯、金钟柏-2,4(10)-二烯、β-侧柏烯、β-蒎烯、月桂烯、α-水芹烯、对伞花烃、罗勒烯、γ-松油烯、柠檬烯、衣兰烯、α-荜澄茄油烯、异喇叭烯、β-波旁烯、石竹烯、香橙烯、雪松烯、α-石竹烯和γ-木罗烯；醇类化合物11种(4.24%)，即龙脑、1-松油醇、1,3,3-三甲基-双环[2.2.1]庚-2-醇、4-萜烯醇、α-松油醇、1,2-二甲基-3-(1-甲乙烯基)环戊醇、6-崁烯醇、荜澄茄油烯醇、α-毕橙茄醇、α-红没药醇和表蓝桉醇；酮类化合物2种(0.22%)，即2-十一烷酮和2-十三烷酮；醛类化合物1种(0.02%)，即反-2-十二烯醛；酯类化合物2种(0.24%)，即乙酸龙脑酯和月桂酸乙酯；氧化物类化合物1种(0.10%)，即石竹烯氧化物。挥发油中相对百分含量大于1%的化合物：烃类有7种(87.77%)，即α-蒎烯、β-侧柏烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、柠檬烯和石竹烯；醇类有1种(2.99%)，即α-松油醇。而酮类、醛类、酯类和氧化物类在本试验中各成分相对百分含量均低于1%。

2.2 雪松松针挥发油的抗氧化活性2.2.1 雪松松针挥发油对DPPH·的清除作用

DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能将其清除，则表明受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链式等作用。由图2可知，雪松松针挥发油对DPPH·具有一定的清除作用，挥发油浓度为0.8 μg·mL-1时，清除率为79.56%，但清除率略高于同浓度的VC。挥发油对DPPH·的清除率随着挥发油浓度的增加而增大，两者呈正相关，挥发油浓度(x)与清除率(y)的回归方程为y=49.143x+35.434(R2=0.95)，IC50(清除率为50%时样品的浓度)为0.30 μg·mL-1；VC质量浓度(x)与清除率(y)的回归方程为y=57.711x+23.211(R2=0.96)，对照品VC的IC50为0.46 μg·mL-1。

图2 雪松松针挥发油对DPPH·的清除效果Fig.2 DPPH·scavenging effects of volatile oil from the pine needles of C.deodara

2.2.2 雪松松针挥发油对ABTS·的清除作用

ABTS·清除法是被国内外广泛应用的一种测定总抗氧化能力的方法，其具有操作简单、快速等优点。由图3可知，雪松松针挥发油对ABTS·具有一定的清除作用，清除效果优于VC，且随着样品浓度的增加，两者清除率的差异逐渐减小。挥发油浓度(x)与清除率(y)的回归方程为y=39.444x+41.452(R2=0.86)，IC50为0.22 μg·mL-1；VC浓度(x)与清除率(y)的回归方程为y=52.76x+19.034(R2=0.93)，对照品VC的IC50为0.59 μg·mL-1。

图3 雪松松针挥发油对ABTS·的清除效果Fig.3 ABTS· scavenging effects of volatile oil from the pine needles of C.deodara

2.2.3 雪松松针挥发油对·OH的清除作用

羟自由基在生物体内可与脂类糖类、多肽、蛋白质、DNA，尤其是硫胺和鸟苷发生反应，是目前所知活性氧中活性最强、危害最大的一种自由基。由图4可知，随着挥发油浓度的升高，对·OH的清除率也随着增大，当挥发油浓度为0.8 μg·mL-1时，清除率为42.22%，挥发油浓度(x)与清除率(y)的回归方程为y=44.751x+6.8976(R2=0.83)；VC浓度(x)与清除率(y)的回归方程为y=57.124x+19.995(R2=0.93)；雪松松针挥发油和VC的IC50分别为0.96和0.53 μg·mL-1。

图4 雪松松针挥发油对·OH的清除效果Fig.4 ·OH scavenging effects of volatile oil from the pine needles of C.deodara

3 讨论

本试验结果与李晓凤等[8]对雪松枝叶挥发油的化学成分分析的结果存在相似性，α-蒎烯、莰烯、β-侧柏烯、β-蒎烯、α-水芹烯、柠檬烯、α-石竹烯、对伞花烃、γ-木罗烯、龙脑、α-松油醇和石竹烯氧化物均是两者共有的化学成分。本试验所检测到的挥发油化学成分和前人[8]一样多，为37种，金钟柏-2,4(10)-二烯、月桂烯、罗勒烯、γ-松油烯、衣兰烯、α-荜澄茄油烯、异喇叭烯、β-波旁烯、石竹烯、香橙烯、雪松烯、1-松油醇、1,3,3-三甲基-双环[2.2.1]庚-2-醇、4-萜烯醇、1,2-二甲基-3-(1-甲乙烯基)环戊醇、6-崁烯醇、荜澄茄油烯醇、α-毕橙茄醇、α-红没药醇、表蓝桉醇、2-十一烷酮、2-十三烷酮、反-2-十二烯醛、乙酸龙脑酯和月桂酸乙酯首次在本试验中发现。导致以上结果的原因可能是采集的时间、采集的地点以及挥发油提取过程中提取条件的差异等因素造成的，有待于进一步研究。

雪松松针挥发油化学成分比较复杂，含有多种具有应用价值的化学成分。α-蒎烯是雪松松针挥发油的重要组成成分，能合成多种香料，具有很强的抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化剂和镇痛等[9～13]生物活性；β-蒎烯不但能人工合成多种香料，而且还是樟脑，冰片、维生素A、E、K、萜烯树脂等的重要原料，具有抗真菌、抗病毒、抗血压等用途[14～17]；月桂烯是香料产业中重要的化学品原料和中间体，可合成薄荷，柠檬醛，香茅醇，香叶醇，橙花醇和芳樟醇等[18]；柠檬烯是食物、肥皂和香料的添加剂，具有抗胃病、抗恶性细胞增生等作用[19～21]；α-松油醇可用作食用香料等[22]。此外，雪松松针挥发油中还有一些化学成分，其功效目前尚未明确，有待于进一步研究。

自由基是细胞代谢的副产物，具有高度氧化作用，人体内过多的自由基可引起衰老和多种疾病的发生，抗氧化剂可清除自由基，调整和改善人体生理功能，有助于人体抵抗疾病、延缓衰老[23]。人工合成的抗氧化剂具有潜在的毒性和致癌作用，大多数国家已限制甚至禁止使用，而天然抗氧化剂因其安全、无毒、高效等优点备受人们关注和欢迎。本研究结果表明，雪松松针挥发油对DPPH·、ABTS·和·OH 3种自由基的清除能力与样品挥发油浓度有明显的量效关系，随着挥发油浓度的升高，对这3种自由基的清除能力逐渐增强。当挥发油浓度达到1.2 μg·mL-1时，对DPPH·、ABTS·和·OH的清除率分别达到90.86%、85.43%及53.37%。雪松松针挥发油对DPPH·、ABTS·和·OH的IC50值分别为0.30、0.22及0.96 μg·mL-1，以IC50值为指标，雪松松针挥发油对3种自由基的清除能力大小为：ABTS·>DPPH·>·OH。另外，雪松松针挥发油对DPPH·和ABTS·的清除作用均优于VC，而对·OH的清除作用却略低于VC，说明雪松松针挥发油具有较好的体外抗氧化活性，但其体内抗氧化活性及药理作用有待进一步研究。

4 结论

挥发油是雪松的主要生物活性成分，对雪松松针挥发油化学成分和生物活性研究有重要意义。本试验从雪松松针挥发油中分离鉴定出37种化合物，含有烃类、醇类、酮类、醛类、酯类及氧化物类等成分，其中以烃类和醇类为主，占94.52%。雪松松针挥发油中含有多种在食品、医药、化工等方面有重要用途的物质，如α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和柠檬烯等。雪松松针挥发油具有较好的抗氧化活性，在一定的质量浓度范围内，对DPPH·、ABTS·和·OH的IC50分别为0.30、0.22及0.96 μg·mL-1，且呈现一定的量效关系。

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The Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20151278);Science and technology projects of northern jiangsu in Jiangsu province(BN2014029)

introduction：HU Wen-Jie(1974—),male,Doctor,Mainly engaged in natural product chemistry.

date:2017-02-21

ChemicalComponentsandAntioxidantActivityofVolatileOilfromPineNeedlesofCedrusdeodara

HU Wen-Jie1LUO Hui2ZOU Lin-Hai1LI Guan-Xi3*

(1.College of Life Sciences,Jinggangshan University,Ji’an 343009；2.School of Medicine,Jinggangshan University,Ji’an 343000；3.School of Life Sciences,Qufu Normal University,Qufu 273165)

The volatile oil from pine needles ofCedrusdeodarawas extracted by water-steam distillation and analyzed by GC-MS. The antioxidant activity of volatile oil was evaluated by DPPH·, ABTS· and ·OH scavenging capacity with VCas the positive control. Thirty-seven components, accounting for 95.10% of total components, were identified. Olefin hydrocarbon and alcohols were found to be dominant components in the volatile oil. The volatile oil exhibited significant scavenging capacity against DPPH·, ABTS· and ·OH in a concentration fashion. When the scavenging rate against DPPH·, ABTS· and ·OH of volatile oil was 50%, the contents of volatile were 0.30, 0.22 and 0.96 μg·mL-1, respectively. The volatile oil from pine needles ofC.deodaracontains a variety of chemical composition of application value with a certain antioxidant activity.

Cedrusdeodara;volatile oil;chemical components;GC-MS;antioxidant activity

江苏省自然基金(BK20151278)；江苏省苏北科技项目(BN2014029)

胡文杰(1974—)，男，博士，主要从事天然产物化学研究。

* 通信作者：E-mail:1040411985@qq.com

2017-02-21

* Corresponding author：E-mail:1040411985@qq.com

S682.31；Q945.6+4

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.019