松栎柱锈菌春孢子多糖体外抗氧化活性

2017-11-11邸雪颖贾舒涵瓮岳太

植物研究 2017年4期

关键词：锈菌孢子自由基

邸雪颖贾舒涵薛煜杨光赵博瓮岳太

(东北林业大学林学院，哈尔滨 150040)

松栎柱锈菌春孢子多糖体外抗氧化活性

邸雪颖贾舒涵薛煜杨光赵博瓮岳太*

(东北林业大学林学院，哈尔滨 150040)

松栎柱锈菌春孢子；多糖；自由基；抗氧化

松栎柱锈菌(CronartiumorientaleS.Kaneko.)是引起松瘤锈病的森林有害生物，是一种长循环型转主寄生菌，其春孢子阶段寄生在樟子松(PinussylvestrisL. var.mongolicaLitv.)、兴凯湖松(P.takahasiiNakai)等二针松的枝干部[1]。其寄主樟子松是我国北方干旱地区广为引种的重要造林树种，生长迅速，材质良好；其转主寄主蒙古栎(QuercusmongolicaFisch. ex Ledeb.)耐干燥瘠薄，树皮、壳斗、叶等可提取栲胶，其木材是我国重要的橡木代用品。松树被侵染形成松瘤后，松栎柱锈菌就会长期寄生在寄主松树上，并且肿瘤会逐年增大，给松栎混交林林分健康和林木生长造成极大危害[2]。已有大量研究结果表明多数担子菌(Basidiomycetes)多糖具有很好的抗氧化作用，能有效清除多种自由基，对生物体的毒副作用非常小，具有抗病毒、抗衰老、降血糖、抗肿瘤、免疫调节等生物学功效，并能提高谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，是一类能够控制细胞生长、衰老、分裂分化的生物代谢产物[3～4]。松栎柱锈菌春孢子孢壁的结构复杂且耐酸碱，理化性质稳定，其主要成分为几丁质和少量甘露聚糖，以及钙(Ca)、硅(Si)等矿物元素。由这些物质构成的孢壁限制了孢子内含物的释放，给研究人员研究孢子内含物生物活性的工作带来了诸多困难[5～6]。所以，要获得松栎柱锈菌春孢子多糖就势必要对其进行破壁处理且要保证较高破壁率。

高压均质技术是一种便捷、快速、高效的动态高压处理技术，现已广泛用于工业生产中物料的细化与分散，饮料、乳品、化妆品等化工行业应用最多[7～9]。其实质是对料液以数百兆帕的压力剧烈压缩，使得料液以超过1 000 m·s-1的流速流出并撞击到特制的碰撞环而使物料破碎。锈菌目(Uredinales)隶属担子菌门(Basidiomycota)，但是目前尚未发现任何关于锈菌目真菌多糖的研究，这也表明我们对于锈菌目真菌多糖知之甚少。本研究选择了松栎柱锈菌春孢子为研究对象，对松栎柱锈菌春孢子破壁处理，以提取其多糖并研究其体外抗氧化活性，旨在为锈菌目菌物开发利用、森林有害生物开发利用和提升与扩宽森林有害生物防治理念提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与预处理

1.2 多糖的提取和纯化方法

本研究所采用的松栎柱锈菌春孢子多糖提取工艺流程为：松栎柱锈菌春孢子采集→45℃烘干至恒重→高压均质破壁处理→60℃热水浸提2 h→抽滤→提取液浓缩→sevage法除蛋白→真空旋转蒸发→透析除杂→乙醇沉淀→离心收集沉淀→去脂→干燥→精制多糖。

松栎柱锈菌春孢子破壁：准确称取25.0 g松栎柱锈菌春孢子置于装有5 L蒸馏水的容器中，超声振荡处理并每隔3 min摇匀一次，至所有春孢子完全散开为止。打开高压均质机，将压力增至900Bar，对混匀的松栎柱锈菌春孢子进行高压均质破壁处理，破壁两次。

将上述方法处理所得上清液于4℃条件下透析处理72 h，然后加入5倍体积的无水乙醇静置过夜。离心收集沉淀后，对所得沉淀分别使用无水乙醚和无水丙酮洗涤三次，以达到去脂和脱水的目的。

1.3 松栎柱锈菌春孢子多糖得率计算

精确称取25 g松栎柱锈菌春孢子，按照1.2中的多糖提取方法提取多糖，对得到的干燥多糖使用分析天平称重，按式(1)计算多糖得率。

(1)

式中：D为多糖得率；M1为提取到的多糖质量(g)；M2为提取过程所用松栎柱锈菌春孢子粉干重(g)。

1.4 苯酚—硫酸法测定多糖含量

1.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制

按照1.2的多糖提取方法提取多糖，多糖溶液质量浓度按照文献10的方法测定[10]，以吸光值A为纵坐标，质量浓度为横坐标，得出葡萄糖标准曲线。按式(3)计算多糖含量。

1.4.2 换算因素f的测定

精密称取1.2所得松栎柱锈菌春孢子多糖100 mg，加入少许蒸馏水溶解，定容至10 mL容量瓶中，摇匀备用，得浓度为10 mg·mL-1的多糖样品溶液。取样品溶液稀释至所需浓度，按照绘制标准曲线的方法测定吸光度，并根据标准曲线回归方程计算多糖质量浓度，按公式(2)计算换算因素f

(2)

式中：W为称取多糖的质量(mg)；C为多糖供试液中葡萄糖浓度(mg·mL-1)；B为多糖的稀释倍数；V为多糖储备液体积(mL)。

1.4.3 样品多糖含量测定

精确称取8.124 8 g松栎柱锈菌春孢子，按照1.2的多糖提取方法提取多糖，将所得精制多糖配置成体积为10 mL的多糖溶液。将上述多糖溶液稀释125倍，按照标准曲线的方法测定吸光度，并根据标准曲线计算多糖质量浓度，按式(3)计算多糖含量。

(3)

式中：C为供试液中的葡萄糖质量浓度(mg·mL-1)；B为稀释倍数；V为样品溶液体积(mL)；f为换算因素；M为供试春孢子的质量(mg)；P为春孢子破壁率。

1.5 抗氧化活性的测定

1.5.1二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定

11的方法，并稍加修改[11]。用95%乙醇溶液配置DPPH·浓度为0.2 mmol·L-1的乙醇溶液。避光置于冰箱中冷藏备用。测定方法:在2 mL DPPH·乙醇溶液中加入2 mL样品溶液，对照管用95%乙醇代替DPPH·溶液；空白管用蒸馏水代替多糖溶液。混匀器混匀后避光反应30 min。波长调至517 nm处用0.5 mL蒸馏水和2.5 mL 95%的乙醇调零，然后测定反应液吸光值，每个浓度设置三个平行实验，结果取平均值。DPPH·自由基的清除率用公式(4)计算。以抗坏血酸Vc做阳性对照，用以评价春孢子多糖对DPPH·的清除能力。

(4)

式中：A0为2 mL DPPH·乙醇溶液+2 mL超纯水的吸光值；A1为2 mL DPPH·乙醇溶液+2 mL样品溶液后的吸光值；A2为2 mL样品溶液+2 mL超纯水的吸光值。

1.5.2 总还原力的测定

参照文献12，并稍加改进[12]。用蒸馏水将多糖溶液稀释至所需浓度，向试管中加入多糖溶液1.0 mL，0.2 mol·L-1的pH6.6的磷酸缓冲溶液2.5 mL，快速混匀后加入质量分数1%的铁氰化钾溶液2.5 mL并置于50℃水浴20 min。迅速冷却反应液并加入体积分数为10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，充分混匀，3 000 r·min-1离心10 min。取上清液3 mL，依次加入3 mL蒸馏水和1.0 mL的0.1%的三氯化铁溶液，充分混匀后静置10 min，于700 nm波长下测定溶液吸光度。吸光度越大还原能力也越大。以抗坏血酸Vc做阳性对照，用以评价春孢子多糖总还原力。

A700=A样品-A空白

(5)

1.5.3 其他指标测定

2 结果与分析

2.1 松栎柱锈菌多糖换算因子f

一般情况下，多糖的单糖组成不止一种，不同的单糖经苯酚一硫酸法显色后在490 nm处的光吸收值一般是不一样的。我们制作标准曲线时采用的标准品是纯度非常高的葡萄糖，而松栎柱锈菌多糖完全水解之后并不全是葡萄糖，这样就会带来一定的误差，因此检测结果需用换算因素f加以校正。经苯酚—硫酸法测定多糖含量，使用公式(2)计算得换算因子f=4.05。

2.2 松栎柱锈菌春孢子多糖含量测定

精确称取25 g春孢子，按照1.2中的多糖提取方法，得质量为0.307 7 g的春孢子多糖，则该提取工艺下松栎柱锈菌春孢子多糖得率为1.23%。绘制的葡萄糖标准曲线如图1所示，回归方程为：

y=13.42x-0.004 6

(6)

式中：y为检测液在490 nm处的吸光度；x为检测液中葡萄糖质量浓度，方程的拟合度R2≈0.999。

在此基础上按照公式(3)计算得知松栎柱锈菌春孢子多糖含量约为1.10%。

2.3 春孢子多糖对DPPH·的清除能力

从图2可以看出，松栎柱锈菌春孢子多糖对DPPH·的清除率并不具有明显的量效关系，清除率并未随着多糖浓度的增大而增大。而在相同浓度范围内，Vc的清除率接近最大值，处于持平状态的波动，在这一浓度范围也不具有量效作用。通过与Vc的对比实验，可以看出春孢子多糖对DPPH·的清除作用非常弱，远低于Vc对DPPH·的清除能力。

图1 苯酚—硫酸法标准曲线Fig.1 Standard curve by phenol-sulfuric acid method

图2 受试物清除DPPH·能力的比较Fig.2 Comparison of DPPH· radical scavenging capacity of the polysaccharides and Vc

2.4 春孢子多糖总还原力

还原力是评价抗氧化能力的重要指标之一，其原理是具有较强还原力的物质将Fe3+还原为Fe2+，Fe2+在酸性环境下与FeCl3产生有颜色的普鲁士蓝。还原力越强，对应的吸光值也越大。在对比相同质量浓度下的Vc与松栎柱锈菌春孢子多糖总还原力时，即使使春孢子多糖浓度低至很低的还原力水平时，Vc的还原力依旧超出了分光光度计的量程(0～1.999)，这说明春孢子多糖的总还原力远远低于Vc，还原力很弱。但是，根据图3可以看出当春孢子多糖在0.0312 5～5.0 mg·mL-1时，浓度与还原力具有较好的线性关系，R2≈0.998。

图3 春孢子多糖总还原力Fig.3 Reducing power of the polysaccharides

图4 受试物清除能力的比较Fig.4 Comparison of scavenging capacity of the polysaccharides and Vc

2.6 春孢子多糖对·OH的清除能力

羟基自由基(·OH)属于一种强氧化剂(E0=2.80V，3.06V)，远大于一般氧化剂，是机体中最活跃的一种活性氧分子，具有很强的破坏性[15]。它几乎可以和活细胞中的任何生物分子发生反应而造成损伤，而且反应速度极快。有关氧自由基与核酸碱基反应的机理研究受到了国内外学者的密切关注，尤其是在·OH引起的DNA与RNA损伤方面[16]。因此，清除机体内过多的·OH具有非常重要的生物学意义。通过与Vc的对比实验，可以看出当受试物浓度小于0.625 mg·mL-1时，受试物浓度对羟基自由基(·OH)的清除作用具有较好的量效关系。随着受试物浓度增大，其对羟基自由基(·OH)的清除率达到最高水平，Vc对·OH的清除率最高可达95.7%，松栎柱锈菌春孢子多糖对·OH的清除率最高可达81.6%。多糖与Vc清除·OH的原理不同，多糖通过碳氢链上的氢原子与·OH结合生成水达到清除·OH的作用，而Vc具有很强的还原性，不仅能够直接清除·OH，还能够阻断Fenton反应，从而减少体系中的·OH。从图5可以看出，松栎柱锈菌春孢子多糖对·OH的清除效果很好，经计算半抑制率IC50=0.379 mg·mL-1，存在一定的量效关系，对·OH的清除能力与Vc差别不大，Vc对·OH的半抑制率IC50=0.365 mg·mL-1。

2.7 春孢子多糖总抗氧化能力

生物活性物质总抗氧化能力是指不同活性物质清除不同自由基的有效和。虽然已有多种测定天然抗氧化物的抗氧化活性的方法，但这些方法只是从一个角度来评价天然抗氧化物的多功能作用，而事实上，抗氧化作用可能涉及多种作用机制，它涉及一系列问题，目前尚未形成标准方法[17]。本实验测定总抗氧化能力采用的试剂盒原理为FRAP法，抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，后者迅速与菲啉类物质形成稳固的蓝色络合物，通过比色可测定其抗氧化能力的高低。从图6可以看出相同条件下，春孢子多糖与Fe3+的清除效果存在明显的量效关系，当春孢子多糖浓度达到5 mg·mL-1时，清除率达到了79.6%，而Vc对Fe3+的清除效果始终处于持平状态，总抗氧化能力强于春孢子多糖。经计算，在此测定中，松栎柱锈菌春孢子多糖的半抑制率IC50=1.078 mg·mL-1。

图5 受试物清除·OH能力的比较Fig.5 Comparison of ·OH scavenging capacity of the polysaccharides and Vc

图6 受试物总抗氧化能力的比较Fig.6 Comparison of total antioxidant capacity of the polysaccharides and Vc

3 结论与讨论

3.1 讨论

采用上述方法提取多糖后，测定得知松栎柱锈菌春孢子多糖含量较低，仅有1.10%。本课题组认为松栎柱锈菌春孢子多糖实际含量要高于1.10%，这是因为在多糖的提取与精制过程中，不可避免地会损失一部分多糖。另外，本研究对于该菌春孢子多糖含量的测定工作存在不足，本研究所得多糖含量测定结果是通过与葡萄糖的校正换算得来的，这主要是因为我们无法准确得知所得精制多糖中杂质的量，同时也尚不知晓所得松栎柱锈菌春孢子多糖的单糖组成，这就无法得出匹配度非常高的含量计算方法及标准曲线。

任何生物都有其自身存在的价值，前人对于森林有害生物的研究主要集中在防治方面，目前尚未发现开发利用森林有害生物的研究报道。活体寄生真菌桦褐孔菌(Inonotusobliquus(Pers. Fr.)Aoshi)长期寄生在阔叶树种白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)干部，并最终造成桦树死亡[23]。但是，从未有人将其纳入植物病原生物的范围予以考虑，反而是因为它的保健价值予以开发利用，成为了林区人民增值创收的来源，那么当下我们的知之甚少地松栎柱锈菌又与它相距多远？本课题组认为森林有害生物具备抵偿甚至超过其为林业生产活动带来的损失的能力，即便是森林有害生物也存在被开发利用的潜能，这对提升和扩宽森林有害生物防治理念具有参考意义。

3.2 结论

参考文献

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State Bureau of Forestry 948 project(2015-4-35)

introduction：DI Xue-Ying(1957—),male,professor,specializing in forest fire prevention.

date:2017-01-17

AntioxidantActivitiesofPolysaccharidesfromCronartiumorientaleAeciosporesinvitro

DI Xue-Ying JIA Shu-Han XUE Yu YANG Guang ZHAO Bo WENG Yue-Tai*

(School of forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040)