水蜈蚣总多酚的纯化工艺及抗氧化性研究

杨艳俊，王亚红，吉惠杰

（吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

水蜈蚣总多酚的纯化工艺及抗氧化性研究

杨艳俊，王亚红，吉惠杰

（吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

研究利用大孔吸附树脂对水蜈蚣总多酚进行纯化的最佳工艺及其体外抗氧化性能。采用静态和动态吸附与解吸的方法对水蜈蚣提取液中的总多酚进行纯化，以吸附率和解吸率为指标，利用紫外分光光度计测量总多酚的含量。最佳树脂为DM-301型，最佳动态工艺条件：上样液体积25 mL，总多酚质量浓度为0.834 mg/mL，吸附流速2 BV/h，样品液pH值为2.0，解吸液乙醇体积分数为75%，洗脱液用量为30 mL，洗脱流速3 BV/h。纯化后浸膏中的总多酚纯度可达39.4%。该工艺操作简单，重复性好，适合水蜈蚣总多酚的纯化。考察提取液对DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基的清除能力，并用Vc作为对比，结果表明，水蜈蚣总多酚的抗氧化能力与Vc的抗氧化能力接近。

水蜈蚣；总多酚；纯化工艺；抗氧化

0 引言

水蜈蚣又名三荚草、金钮子、金钮草、水金钗等，为莎草科植物的全草[1]，生于水边、水田及旷野湿地等处，分布于江苏、安徽、浙江、福建、江西、湖南、湖北、广西、广东、四川、云南、东北等地区。水蜈蚣为多年生草本植物，全株光滑无毛，鲜时有菖蒲的香气，主治感冒风寒、寒热头痛、筋骨疼痛、咳嗽、疟疾、黄疸、痢疾、疮疡肿毒、跌打刀伤等[2]。其在临床方面也有应用，如治疗疟疾、乳糜尿[3-4]、菌痢、慢性气管炎等疾病[5]。研究结果表明，水蜈蚣全草中含有牡荆素等黄酮类[1]、挥发油[6-7]、酚酸性成分等[8-9]。生活在闽南、江浙地区的人经常把该种植物捣碎后敷在伤口上，因为它有消肿、消炎止痛的作用，对恶性脓疮治疗效果尤其明显[10]。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗氧化、抗衰老等作用[11-12]。有人对水蜈蚣总黄酮的制剂进行研究提高其溶出度，提高了生物利用率[13-14]。目前，对于水蜈蚣中总多酚的相关报道较少。植物多酚是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物，在维管植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，多酚类物质具有很强的抗氧化作用，已经引起国内外学者的关注[15]。试验对水蜈蚣中总多酚最佳纯化工艺及体外抗氧化性能进行研究，为水蜈蚣的进一步开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水蜈蚣：市售；没食子酸标准品（≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；AB-8、DM-130、D-101、HPD-100、DM-301型大孔吸附树脂：天津市海光化工有限公司；三羟甲基氨基甲烷（≥98.8%）、DPPH（分析试剂）、ABTS（≥97%）：上海伊卡生物技术有限公司。水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T9新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FA2004N电子分析天平：上海精密科学股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总多酚含量的测定[16]

精确称取没食子酸5 mg，用无水乙醇定容至250 mL，配制成质量浓度为20 μg/mL的没食子酸溶液。准确量取1 mL没食子酸，置于25 mL容量瓶中，依次加入无水乙醇4 mL、0.3%十二烷基硫酸钠 2 mL 及 0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）6]（1∶0.9）的混合液1 mL，混匀。在暗处放置5 min，加入0.1 mol/L HCl至刻度，摇匀显色，在暗处放置20 min后，测得没食子酸在748 nm处有最大吸收峰。精确量取 20 μg/mL 没食子酸标准溶液 0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分别置于25 mL容量瓶中，在最大吸收波长处测吸光度，求得标准回归曲线方程为y=0.683x+0.004，R2=0.999，符合要求，没食子酸质量浓度在0.24～2.00 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

1.3.2 静态吸附及解吸试验

在锥形瓶中各加入树脂5 g，加入40 mL水蜈蚣提取液，在2 h内每隔10 min振摇一次，每次30 s，放置48 h后过滤，测经树脂吸附后药液的吸光度，计算总多酚的吸附率。将树脂抽干，加入60 mL 70%乙醇解吸，在2 h内每隔10 min振摇一次，每次30 s，放置48 h后过滤，测树脂解吸后药液的吸光度，计算总多酚的解吸率。

1.3.3 动态吸附及解吸试验

取5 g经静态法优选的树脂5份，湿法装柱，加入水蜈蚣提取原液，以及稀释了1、2、3、4倍的样品溶液各25 mL，以1～5 BV/h的流速进行吸附后，分别收集过柱液，计算树脂对总多酚的吸附率；再以10%～95%乙醇各30 mL以2 BV/h的流速进行解吸，分别收集洗脱液，考察洗脱液的质量浓度、用量及洗脱流速，经吸光度测试后计算溶液质量浓度的变化。

1.3.4 抗氧化试验

1.3.4.1 DPPH法[17]

精确称取19.716 mg DPPH，用无水乙醇溶解定容至250 mL容量瓶中，得C=0.2 mmol/L的DPPH溶液。 量取水蜈蚣提取液 0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL，用蒸馏水定容至10 mL容量瓶中，质量浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL。将不同质量浓度的供试品溶液量取2 mL分别放置在10 mL比色管中，加入2 mL DPPH溶液（C=0.2 mmol/L），在暗处放置30 min，在517 nm处测定吸光度A1。对照组加入2 mL无水乙醇，测定吸光度为A2。用2 mL蒸馏水代替供试品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均匀后，在暗处放置30 min后，测定吸光度记为A3。

用 Vc作为对照，将 Vc 配成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL溶液，按照供试品溶液的方法进行试验，测定Vc对DPPH自由基的清除能力。

DPPH 清除率（%）=（A3-A1+A2）/A1×100。

1.3.4.2 ABTS法[18]

ABTS自由基阳离子的配制：精确称取96.075 mg ABTS置于25 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，配制成浓度为7 mmol/L的ABTS溶液，称取0.13 g过硫酸钾置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，制备2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液。按照1∶1比例各取溶液10 mL配制混合溶液，并置于23℃的避光处放置18～20 h，制备ABTS储备液。稀释后在波长734 nm处测得吸光度为0.700±0.005，得ABTS自由基阳离子基液，吸光度值为A空白。取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的供试品溶液 0.1 mL，置于10 mL比色管中，分别加入3.9 mL工作基液混合摇匀，23℃的避光放置6 min，用纯水作为空白对照，测其吸光度值A。用Vc作为对照，将Vc配成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 按照上述方法进行试验，测得Vc对ABTS自由基阳离子的清除率。

ABTS阳离子自由基清除率=（A空白-A）/A空白×100%。

1.3.4.3 超氧阴离子自由基的清除能力测定

取3 mL Tris-HCl缓冲溶液，分别加入0.5 mL不同质量浓度的供试品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、6.0 mg/mL和2 mL邻苯三酚溶液，加入10 mmol/L HCl溶液1 mL，于320 nm波长处测其吸光度A1。取3 mL Tris-HCl缓冲溶液分别置于25℃水浴中预热20 min，分别加入0.5 mL不同质量浓度的供试品溶液和2 mL蒸馏水，混匀后于25℃水浴中反应 8 min，加入 10 mmol/L HCl溶液 1 mL，测其吸光度A2。取3 mL Tris-HCL缓冲溶液分别置于25℃水浴中预热20 min，分别加入0.5 mL不同质量浓度的供试品溶液和2 mL邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应8 min，加入0.05 mmol/L HCl溶液1 mL，测其吸光度A3。Vc作对照配成质量浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 溶液，按照上述供试品的方法进行使用，测定Vc对超氧阴离子自由基的清除率。

超氧阴离子自由基清除率（%）=（A3－A1＋A2）/A3×100。

2 结果与分析

2.1 树脂类型的选择

5种型号的树脂经静态吸附及解吸后得到的溶液的质量浓度如表1所示，DM-301树脂的吸附率及解吸率都较高，选择DM-301为最优树脂进行动态吸附及解吸研究。

2.2 DM-301型大孔吸附树脂吸附工艺优化研究

2.2.1 上柱液质量浓度的考察

取5 g已处理好DM-301型吸附树脂，加入水蜈蚣提取原液，以及稀释了1、2、3、4倍的样品溶液各25 mL，先以2 BV/h的流速进行吸附后，收集过柱液，再对树脂进行解吸，计算吸附率及解吸率，如表2所示。

表1 静态吸附率及解吸率Table 1 Static adsorption rate and desorption rate

表2 上柱液质量浓度的考察结果Table 2 Results of different extract mass concentration

上柱液质量浓度过高时，浪费情况严重，吸附率过低；质量浓度过低时，药液中总多酚量过少，可导致吸附量计算不准确，影响试验结果。在其他纯化条件相同时，随着上柱药液质量浓度的减小，解吸率先增大后又减小，最佳水蜈蚣总多酚纯化的质量浓度为0.834 mg/mL。

2.2.2 吸附速率的考察（表3）

表3 吸附速率考察结果Table 3 Results of different adsorption rate

树脂柱中加入水蜈蚣提取液（质量浓度为0.845 mg/mL），分别以1～5 BV/h的流速进行吸附，收集过柱液，再对树脂进行解吸。对吸附后液体及解吸液分别取样进行含量测定，得出总多酚浓度，计算吸附率及解吸率。

随着吸附速率的加快，树脂对水蜈蚣总多酚的吸附率先增大后减小，解吸率先增大后减小又增大，依据试验结果确定最佳水蜈蚣总多酚吸附速率为2 BV/h。

2.2.3 解吸液体积分数的考察（表4）

表4 解吸液体积分数考察结果Table 4 Results of different eluent volume fraction

方法同2.3.1，洗脱液分别为10%、30%、50%、75%、95%乙醇各60 mL以2 BV/h的流速进行解吸，收集洗脱液。对吸附后液体及解吸液分别取样进行含量测定，得出各液体总多酚浓度，计算吸附率及解吸率，以解吸率为指标进行条件择优。

解吸液体积分数对水蜈蚣总多酚纯化有较大的影响，随解吸液体积分数的增加，解吸率先是大幅度增加，之后缓慢下降，由表4得出，解吸液为75%乙醇时解吸率最高，所以确定解吸液最佳体积分数为75%。

2.2.4 解吸速率的考察（表5）

表5 解吸速率考察结果Table 5 Results of different eluent flow rate

方法同 2.3.2，以 1、2、3、4、5 BV/h 的流速进行洗脱，收集洗脱液。对吸附后液体及解吸液分别取样进行含量测定，得出各液体总多酚质量，计算吸附率及解吸率，以解吸率为指标进行条件择优。

洗脱速率过快，洗脱不完全，浪费溶剂，洗脱速率过慢，洗脱时间延长，生产效率降低。由表5可以看出，在其他纯化条件相同时，解吸率在洗脱速率为3～4 BV/h时较高，依据试验结果确定最佳水蜈蚣总多酚解吸速率为3 BV/h。

2.2.5 洗脱终点考察（表6）

表6 洗脱终点考察Table 6 Results of eluent end point

方法同2.3.1，加入水蜈蚣上柱液50 mL，以2 BV/h的流速进行吸附，收集过柱液。以75%乙醇3 BV/h的流速进行解吸，每5 mL收集洗脱液，测定含量，确定洗脱终点。

当解吸液用量为6 BV时已基本将水蜈蚣总多酚解吸完毕。解吸液体积过小，不能够将水蜈蚣总多酚解吸完全，若解吸液体积过大，则会造成不必要的浪费。因此，选择适当的解吸液体积，可以既满足试验要求又不会造成试剂浪费。综上，在试验条件不变的情况下，使用30 mL解吸液已接近洗脱终点，所以体积选用30 mL。

2.2.6 上柱液pH的考察（表7）

表7 上柱液pH值考察Table 7 Results of different pH values

方法同2.3.1，使用稀HCl溶液和稀NaOH溶液分别调节提取液 pH 为 1、2、3、4、5，吸附后再用75%乙醇各30 mL以3 BV/h的流速进行解吸，收集解吸液，以吸附率为指标进行条件择优。

在其他纯化条件相同时，随着上柱药液pH值变化，吸附率先增大后减小，最佳上柱药液pH值为2。

2.3 DM-301型大孔吸附树脂纯化水蜈蚣总多酚工艺验证

取pH值为2的水蜈蚣上柱液25 mL，以2 BV/h流速进行吸附，待充分吸附后，测吸光度，计算吸附率，然后用30 mL体积分数为75%的乙醇进行解吸，待解吸后测解吸液吸光度。量取解吸液25 mL制作浸膏，试验结果见表8、表9。

表8 DM-301型大孔吸附树脂纯化水蜈蚣总多酚验证试验结果（一）Table 8 Verification results of DM-301 resin purifying total polyphenols（I）

表9 DM-301型大孔吸附树脂纯化水蜈蚣总多酚验证试验结果（二）Table 9 Verification results of DM-301 resin purifying total polyphenols(II)

由表8可知，吸附率平均值90.71%，解吸率平均值87.62%。

2.4 抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基的清除能力（图1）

水蜈蚣提取液对DPPH自由基清除率分别为59.8%、69.32%、75.81%、83.01%、90.67%、97.15%，Vc对DPPH自由基清除率分别为57.60%、63.07%、72.71%、77.08%、89.32%、96.47%。

图1 水蜈蚣提取液与Vc溶液对DPPH自由基清除能力对比Fig.1 Comparison of DPPH radical scavenging ability of extracts and Vc solution

由图1可知，水蜈蚣提取液对DPPH自由基清除能力随着质量浓度的增大而增大，对DPPH自由基的清除能力略低于Vc。但仍具有极强的清除能力，当质量浓度为0.6 mg/mL时清除率能达到96.47%。

2.4.2 ABTS自由基的清除能力（图2）

图2 水蜈蚣提取液与Vc溶液对ABTS自由基清除能力对比Fig.2 Comparison of ABTS radical scavenging ability of extracts and Vc solution

水蜈蚣提取液对ABTS自由基清除率分别为39.92%、48.16%、55.83%、63.92%、84.8%、86.93%，Vc对ABTS自由基清除率分别为53.85%、59.81%、65.01%、76.51%、84.33%、91.2%。

由图2可知，水蜈蚣提取液对ABTS自由基清除率随着提取液质量浓度的增大而增大，在质量浓度为0.6 mg/mL时，对ABTS的清除率达到86.93%。

2.4.3 对超氧阴离子自由基的清除能力（图3）

图3 水蜈蚣提取液与Vc溶液对超氧阴离子自由基清除能力对比Fig.3 Comparison of superoxide anion radical scavenging ability of extracts and Vc solution

水蜈蚣提取液对超氧阴离子自由基清除率分别为 60.62%、74.89%、77.68%、83.96%、88.18%、95.09%，Vc对超氧阴离子自由基清除率分别为44.54%、56.30%、62.13%、72.55%、80.84%、93.84%。

由图3可知，水蜈蚣提取液对超氧阴离子自由基清除能力随着水蜈蚣提取液的质量浓度增大而增大，当提取液质量浓度为0.6 mg/mL时，清除率可达到95.09%。

3 结论

DM-301型大孔吸附树脂纯化水蜈蚣总多酚的最佳工艺条件为：上柱液总多酚质量浓度为0.834 mg/mL、pH值为 2、吸附速率为 2 BV/h，解吸液为75%乙醇溶液，解吸液体积为30 mL，解吸速率为3 BV/h，纯化后总多酚纯度由原来的11.4%提高到39.4%，树脂富集倍数约为3.5倍，表明DM-301型大孔树脂对水蜈蚣总多酚具有一定的纯化性能。紫外可见分光光度计分析法稳定、精密，采用该方法符合试验要求，适用于水蜈蚣总多酚纯化研究试验。水蜈蚣总多酚提取液对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基清除能力的试验表明，水蜈蚣提取液与Vc溶液具有相近的体外抗氧化活性。

［1］葛正华，胡忠勤，苏晓伟，等.水蜈蚣化学成分研究［J］.中医药学报，1995（5）:21-22.

［2］巨军，李洪珠，刘慧，等.水蜈蚣药学研究进展 ［J］.安徽农业科学，2014，42（4）:983-984，1034.

［3］杨利.水蜈蚣治疗乳糜尿验案举隅［J］.湖北民族学院学报（医学版），2011，28（4）:49.

［4］王亚莉，程龙.水蜈蚣颗粒质量标准研究［J］.中国民族民间医药，2011，14（2）:14-15.

［5］黄琼，宁振兴，田玉红，等.江苏水蜈蚣总黄酮提取工艺的研究［J］.广西工学院学报，2011，22（2）:24-27.

［6］何斌，侯震，彭新君.水蜈蚣挥发油化学成分的研究 ［J］.湖南中医学院学报，2005，25（2）:28-29.

［7］宁振兴，王建民，田玉红，等．水蜈蚣精油的成分分析及其在卷烟中的应用研究［J］．天津农业科学，2012，18（2）:55-57.

［8］潘乐，李立青，徐强.Box-Behnken效应面法优化超声提取水蜈蚣多酚工艺［J］．中成药，2014，36（6）:1302-1306.

［9］黄琼，宁振兴，田玉红，等.广西水蜈蚣总黄酮提取工艺的研究 ［J］.食品科技，2011，36（10）:196-199.

［10］贤景春，傅彩红.水蜈蚣总多酚提取工艺及其提取物的抗氧化性研究［J］.安徽农业科学，2010，38（33）:18763-18764，18767.

［11］贤景春，陈巧劢，赖金辉，等.水蜈蚣总黄酮提取及对羟自由基的清除作用［J］.江苏农业科学，2011（03）:427-429.

［12］葛立军，朱振洪，陈蒋丽，等.响应面法优化水蜈蚣总黄酮的提取及其抗氧化性研究［J］. 浙江中医药大学学报，2014，38（4）:461-468.

［13］孙彩霞，尹蓉莉，赵俊霞，等.水蜈蚣总黄酮固体分散体的制备及其性质研究［J］.中草药，2014，45（14）:2018-2021.

［14］孙彩霞，赵俊霞，苏建春，等.水蜈蚣总黄酮固体分散体微孔渗透泵控释片的处方优化研究［J］.中草药，2014，45（19）:2782-2786.

［15］刘晓字，张俊杰，王蕊霞．葛根总黄酮的提取及抗氧化活性评价研究［J］．食品科学，2007，28（10）:232-237.

［16］薛培凤，李占军，解红霞，等.分光光度法测定蒙药河柏中总酚酸的含量［J］．内蒙古医学院学报，2011，33（1）:43-47.

［17］邵盈盈.蓝莓总黄酮的提取纯化及紫心甘薯总黄酮的抗衰老作用评价［D］.杭州：浙江大学，2013.

［18］马英，田丽萍，高婷婷，等.新疆芍药与窄叶芍药根中多糖含量测定及体外抗氧化活性的研究［J］.石河子大学学报（自然科学版），2014，32（5）：573-578.

PURIFICATION PROCESS OF TOTAL PHENOLIC ACIDS FROM KYLLINGABREVIFOLIAROTTB AND ITS ANTIOXIDANT ACTIVITY

YANG Yanjun，WANG Yahong，JI Huijie
(School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin132022，China)

The optimum purificaiton process and the antioxidant activity of the total polyphenols fromKyllinga brevifoliaRottb by use of macroporous resin were studied. The total polyphenols inKyllinga brevifoliaRottb extract were purified by static and dynamic adsorption and desorption to calculate adsorption rate and desorption rate，and the content of the total polyphenols were determined by ultraviolet spectrophotometer. Results showed that the resin DM-301 was most suitable for purification; the optimum dynamic conditions were as follows:loading amount 25 mL，the mass concentration of total polyphenols 0.824 mg/mL，absorption flow rate 2 BV/h，sample pH 2.0，desorption solution （ethanol）volume fraction 75%，eluent amount 30 mL，and eluent flow rate 3 BV/h. The purity of the total polyphenols in the purified extract reached 39.4%. The process is simple in operation，repeatable，and suitable for purification of total polyphenols fromKyllinga brevifoliaRottb. The scavenging ability of total polyphenols to DPPH，ABTS and superoxide anion free radicals were studied by selecting Vc as contrast，and results showed that the antioxidant activity of the total polyphenols fromKyllinga brevifoliaRottb was similar to that of Vc.

Kyllinga brevifoliaRottb；total polyphenol；purification；oxidation resistance

TS 201.2 文献标志码：B

1673-2383(2017)05-0076-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171030.0936.028.html

网络出版时间：2017-10-30 9:36:39

2017-02-12

吉林化工学院项目（吉化院合字[2015]第44号）

杨艳俊（1974—），女，吉林吉林人，硕士，讲师，研究方向为天然产物的提取及精制。