海藻酸钠包埋希瓦氏菌及其对活性艳红X—3B脱色研究

肖力彬+刘柳+汪聪+蔡亚君

摘 要：本研究分析腐败希瓦氏菌4H菌株通过海藻酸钠进行固定化以后对偶氮染料活性艳红X-3B的处理效果。首先以该菌培养至对数生长期的菌体为对象，确定了在CaCl2浓度为1.5%、海藻酸钠浓度为2.5%、微球粒径0.6mm时包埋得到的微球性能最佳。用包埋了腐败希瓦氏菌4H菌体的微球分别在不同的pH、温度、染料浓度等条件下处理活性艳红X-3B，在pH为5和9时，微球对50mg/L活性艳红X-3B35℃静置处理8h时的脱色率分别为70.8%和67.7%，而菌悬液只有34.2%和47.6%；在温度分别为20℃和50℃时，对50mg/L活性艳红X-3B静置处理12h时的脱色率分别为73.1%和62.7%，而菌悬液只有57.6%和27.3%；在染料浓度高达1600mg/L和3200mg/L时，微球对pH7的活性艳红X-3B在35℃静置处理48h时的脱色率分别为95.3%和94.1%，菌悬液为92.3%和91.3%。结果显示，腐败希瓦氏菌4H菌经海藻酸钠包埋固定化后形成的微球对不利环境的耐受性更强，且多次重复利用仍具较好的脱色效果，具有更好的实际应用价值。

关键词：腐败希瓦氏菌；固定化；海藻酸钠；活性艳红X-3B；脱色

废水生物处理是主要利用微生物的分解作用去除水中污染物的方法，成本低且无二次污染，是现代废水处理中应用最广泛的方法之一，但印染废水由于其有机物含量高、可生化性差、色度深、水质变化大，对常规的活性污泥或生物膜等生物处理系统中的微生物（无论是天然微生物还是投加的功能菌）生长代谢影响大，导致生物处理系统消耗快、效率低。针对这一问题，本研究以一株染料脱色菌株为对象，比较将菌体通过海藻酸钠固定化技术包埋在微球里后处理染料废水时对环境条件的耐受度和脱色效果，从而分析利用包埋固定化技术提高印染废水生物处理系统效率的可行性。

一、材料和方法

1.菌株来源 菌株Shewanella putrefaciens 4H为本实验室分离筛选。

2.菌株的活化及生长曲线的测定 将保藏菌种接种到5ml含50mg/L活性艳红X-3B的LB培养基中35℃活化培养，观察脱色时间，如脱色时间过长则重复此步骤，直至脱色时间稳定之后，将菌液按1：100比例转接至50ml含50mg/L活性艳红X-3B的LB培养基中35℃培养，定时取样检测培养物的OD600和OD525，根据OD600绘制生长曲线，确定生长曲线中对数生长期的时间段。同时根据 OD525 计算不同时间的脱色率，确定脱色完全所需时间。

3.海藻酸钠包埋固定化条件研究 以对数生长期菌体（无菌水洗涤三次）为对象，将菌体用无菌水悬浮至OD600值为1～2的菌悬液，然后取该菌悬液0.5mL与4.5mL的海藻酸钠溶液充分混和，在无菌的100mL小烧杯中倒入60mL氯化钙溶液，用注射器将菌悬液和海藻酸钠的混合物滴入氯化钙溶液之中，即可形成固定化微球。此后将烧杯置于4℃的冰箱中，18h之后取出，去除氯化钙溶液，并用生理盐水洗涤固定化微球3次，再置于4℃冰箱中，保存备用。比较不同的海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、注射器口径对制得微球性能的影响，确定最佳的固定化条件。

4.固定化微球对活性艳红X-3B的脱色研究 将固定化微球在不同温度、pH、染料浓度的条件下处理活性艳红X-3B，以等量菌悬液在相同条件下的处理为对照，分析固定化对菌株生长及脱色性能的影响。并对固定化微球的重复利用效果进行了分析。

二、 结果与分析

1.菌株S. putrefaciens 4H生长曲线的测定

将S. putrefaciens 4H菌株过夜活化培养后按1：100转接至50ml含50mg/L活性艳红X-3B的LB培养基中35℃、200rpm培养，每2h检测培养液的OD600值，以培养时间为横坐标，以OD600值为纵坐标绘得该菌在该培养条件下的生长曲线。

2.菌株S. putrefaciens 4H海藻酸钠固定化研究

将S. putrefaciens 4H菌株过夜活化培养后按1：100转接至50 mL含50 mg/L活性艳红X-3B的LB培养基中35℃、200rpm培养，8h时将培养液离心取菌体，将菌体用无菌水洗涤三次后用无菌水悬浮至OD600值为1.2。将菌悬液按每份0.5ml等量分装，在不同海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、注射器口径的条件下制备固定化微球。

（1） 氯化钙浓度对固定化微球性能的影响。首先，比较了海藻酸钠溶液浓度为3.0%、注射器口径为0.6mm时，氯化钙溶液浓度分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%时制备微球的性能。肉眼观察到微球成球性能均良好。将微球分别转接到5ml含50mg/L活性艳红X-3B的LB液体培养基中35℃静置培养，每2h取样，离心之后测上清的OD525，计算脱色率。结果显示，不同氯化钙浓度时制备得到的微球最终都能脱色完全，但氯化钙浓度为1.5%时在整个处理过程中的表现最好。脱色完全之后观察到的固定化微球的形态仍然良好，对微球外培养液OD600值的检测也显示无游离菌体的存在。

（2）海藻酸鈉浓度对固定化微球性能的影响。在氯化钙溶液浓度为1.5%、注射器口径为0.6mm时，比较海藻酸钠浓度分别为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%时制备得到的微球的性能。肉眼观察到微球成球性能均良好。将微球分别转接到5ml含50mg/L活性艳红X-3B的LB液体培养基中35℃静置培养，每2h取样，离心之后测上清的OD525，计算脱色率。结果显示，海藻酸钠浓度为2.5%时制备得到的微球的脱色效果最好。脱色完全之后观察到的固定化微球的形态仍然良好，对微球外培养液OD600值的检测也显示无游离菌体的存在。

（3） 微球直径对固定化微球性能的影响。在氯化钙溶液浓度为1.5%、海藻酸钠浓度为2.5%时，比较注射器口径分别为0.45mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm时制备得到的微球的性能。肉眼观察到由口径为0.5mm、0.6mm、0.7mm的注射器制备得到的微球成球性能均良好。将微球分别转接到5ml含50mg/L活性艳红X-3B的LB液体培养基中35℃静置培养，每2h取样，离心之后测上清的OD525，计算脱色率。结果显示，由口径为0.6mm的注射器制备得到的固定化微球的脱色效果最好。直径为0.5mm、0.6mm、0.7mm的固定化微球脱色完全之后观察到的形态仍然良好，对微球外培养液OD600值的检测也显示无游离菌体的存在；而直径为0.45mm的微球有部分破碎现象，取样测定OD600值，也检测到有部分游离菌的存在。endprint

3.菌株S. putrefaciens 4H固定化微球对活性艳红X-3B的脱色效果

将固定化微球和等菌量的菌悬液分别转接入不同pH 、含不同浓度活性艳红X-3B的LB液体培养基中，于不同温度静置培养，每2h取样，离心之后取上清检测OD525，计算脱色率。

（1）固定化微球对pH的耐受性研究。将固定化微球和菌悬液分别接入5ml pH分别为5、6、7、8、9的含50mg/L活性艳红X-3B染料的LB液体培养基中35℃静置培养。脱色率检测结果显示，在pH为6、7、8时，菌悬液的脱色效果优于微球，6h脱色率分别为90%左右和70%-80%；而pH为5时，菌悬液浓度不增加，8h脱色率最高仅34.2%，微球8h脱色率为 70.8%；pH为9时，菌悬液浓度增加少，8h脱色率为47.6%，微球为67.7%。

（2）固定化微球对温度的耐受性研究。将固定化微球和菌悬液分别接入5ml pH 7的含50mg/L活性艳红X-3B染料的LB液体培养基中，分别于20℃、30℃、35℃、40℃、50℃静置培养。脱色率检测结果显示，在温度为30、35、40℃时，菌悬液的脱色效果优于微球，6h脱色率分别为90%左右和70%左右；而温度为20℃时，菌悬液浓度增加少，菌悬液12h脱色率最高仅57.6.2%，微球12h脱色率为 73.1%；温度为50℃时，菌悬液浓度不增加，12h脱色率为27.3%，微球为62.7%。

（3）固定化微球对染料浓度的耐受性研究。将固定化微球和菌悬液分别接入5ml pH 7的活性艳红X-3B浓度分别为50mg/L、100 mg /L、200 mg /L、400 mg /L、800 mg /L、1600 mg /L、3200mg/L的LB培养基中，35℃静置培养。脱色率检测结果显示，在染料浓度≤800 mg /L时，菌悬液的脱色效果优于微球，如对浓度≤200 mg /L的染料，微球处理6h脱色率均80%左右，菌悬液均90%左右；对400 mg /L的染料，微球处理6h脱色率为60%左右，菌悬液80%左右；对800 mg /L的染料，微球处理6h脱色率为50%左右，菌悬液60%左右。当染料浓度为1600 mg/L时，菌悬液对染料的脱色率最初优于微球，但是在12h之后微球的脱色效果优于菌悬液，48h时微球脱色率为95.3%，菌悬液为92.3%。当染料浓度为3200 mg/L时，微球的脱色效果优于菌悬液，48h时微球脱色率为94.1%，菌悬液为91.3%。

（4）固定化微球的重复利用性研究。将微球转接入5ml pH7的含50mg/L活性艳红X-3B的LB培养基中，测定起始OD525值及处理6h后OD525值，计算6h脱色率。然后将固定化微球取出后用生理盐水洗涤三次，再转入新的含50mg/L活性艳红X-3B的LB培养基中，检测6h脱色率。重复上述步骤，直到固定化微球破损较为严重。

在第6次重復使用时，其6h脱色率仅比第1次的下降5%左右，脱色性能保持较好，但总体来说随使用次数的增加而呈下降趋势。在前3次重复使用时固定化微球形态良好，没有出现破损，但从第4次开始微球开始出现破损，第6次后固定化微球发生崩解。

三、讨论

本研究结果显示，菌株S. putrefaciens 4H通过海藻酸钠包埋固定化后得到的微球对不利环境的耐受性增强，且可重复利用，表明该菌通过包埋固定化后在对温度、pH、染料浓度等水质参数变化大的印染废水的生物处理中具有了更好的应用前景。而包埋形成的微球之所以能够在不利环境中发挥降解作用，主要是由于固定化载体起到了一个保护屏障的作用，使细胞不直接与外界环境相接触，从而可以抵御土著微生物的恶性竞争、防止或减缓噬菌体、毒性物质及高渗透压物质的吞噬和毒害等；其次，固定化载体内部有较高的孔隙度，可以容纳细胞的增殖，同时细胞分泌的胞外酶可经过孔隙释放到外界降解污染物，或细胞本身可将从孔隙进入的低浓度的污染物直接降解而不受到高浓度污染物的毒害。

本研究所用菌株属于希瓦氏菌属，该属菌株呼吸类型多样，能利用有机物产生能量，能还原金属盐[5-10]、硝酸盐和腐殖酸等有机污染物[7，10]，也能将染料脱色，此外，还发现多个希瓦氏菌株能产电。目前，希瓦氏菌在医学、环境科学、电化学、海洋生物学等多个领域均得到应用，具有很高的研究价值。而本文对希瓦氏菌固定化的研究，也有助于该属细菌在各个领域的更好应用。

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