柱层析纯化6—姜酚的工艺研究

于海　马龙利　陈可可

摘要：以姜油树脂的粗分离物为原料，采用减压梯度柱层析技术对粗分离物中的6-姜酚进行分离纯化，研究了洗脱剂种类、填料比、洗脱剂浓度、硅胶颗粒目数等因素对6-姜酚含量及收率的影响。结果表明，以300～400目硅胶为填料，填料比为100，石油醚、正己烷及乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱剂密度增量为0.005 g/mL，起始浓度范围为0.695～0.725 g/mL，在此工艺参数下对6-姜酚进行减压梯度柱层析分离纯化，可将其含量从55.03%提高到93.04%，收率大于83%。

关键词：姜油树脂；柱层析；6-姜酚

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）19-3717-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.030

Abstract： With ginger oleoresin of crude extracts as raw material，the crude extracts of 6-gingerol were separated and purified by decompression gradient column chromatography. The effects of types of eluent，ratio of filling，elution of gradient，filler particle mesh factors on the content and yield of 6-gingerol were studied. The results showed that 300-400 mesh silica gel was used as filler and the packing ratio was 100. Petroleum ether，hexane and ethyl acetate were used as eluents and the density increment of them was 0.005 g/mL and the initial concentration range was 0.695～0.725 g/mL. Under these process parameters，the content of 6-gingerol could be increased from 55.03% to 93.04% and the yield was higher than 83%.

Key words： ginger oleoresin； column chromatography； 6-gingerol

姜酚（Gingerols）是生姜（Zingiber officinale Rosc.）原料中天然存在的一类辣味成分，呈黄色油状液体，由含有羟基酮结构的烷基链同系物组成的酚类化合物[1]。作为生姜主要生物活性成分之一，姜酚在姜辣素中含量很高[2]。姜酚是一类化合物，可分为单芳环和双芳环庚烷2类。前者主要包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和12-姜酚等10余种成分，后者包含许多成分，其结构差异主要是芳环取代基不同。姜酚中6-姜酚含量最高，占姜酚类物质的75%以上[2]。鲜姜中，6-姜酚含量占总姜辣素80%以上[3]。研究表明，6-姜酚具有多种生物活性，如抗氧化[4]、抗诱变[5]、抗炎[6]、抗癌[7]、抗肿瘤[8]、驱寒、保肝利胆等作用[9]。6-姜酚可用于保健食品和治疗心脑血管、风湿性关节炎、胃溃疡等疾病的药物[10]。

6-姜酚分离纯化方法主要有硅胶柱层析法、大孔吸附树脂法、聚酰胺柱分离法、分子蒸馏技术、制备型高效液相色谱法和高速逆流色谱法等[11-17]。6-姜酚的分离方法中运用最多、最成熟的是柱层析法，这是由于柱层析法不仅可以得到丰富的组分信息，不破坏天然产物中原有成分，而且能分离结构和性质非常相似的化合物，分离出的组分纯度较高[18，19]。既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备[20]。

目前，硅胶柱层析分离纯化6-姜酚的研究中，不同洗脱剂、硅胶颗粒目数等因素对6-姜酚分离效果的试验研究较少，很多研究结果中都没有涉及到6-姜酚的收率，且研究内容以小柱居多，缺少大规格层析柱纯化6-姜酚的工艺参数及试验数据，不利于6-姜酚大规模生产及制备。为了给企业利用大规格层析柱分离6-姜酚提供参考，本研究以普通精制硅胶为填料，采用减压冲柱，洗脱剂梯度洗脱，对姜油树脂的粗分离物（自制）进行了纯化试验研究，也为大规模生产制备6-姜酚奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

6-姜酚含量为55.03%粗分离物（自制），98% 6-姜酚标准品（天津中新药业），GF254板（青岛海洋化工厂），普通精制硅胶（青岛鼎康硅胶有限公司），其余试剂为分析纯。

1.2 仪器及设备

Aglient 1200型高效液相色谱仪（美国Aglient）；旋转蒸发仪（美国BUCHI Labortechnik AG）；XP205电子分析天平（美国METTLER TOLEDO）；循环水式真空泵（山海予英仪器有限公司）；BZF50型真空干燥箱（Boxun）；60 mm×1 200 mm层析柱；Aglient 1260型HPLC。

1.3 方法

1.3.1 装柱及上样 称取适量硅胶，干法装入层析柱（60 mm×1 200 mm）；按比例称取一定质量的6-姜酚粗分离物（6-姜酚含量55.03%），加入1.5～2.0倍乙酸乙酯溶解，再加入2～3倍拌样硅胶（40～80目），搅拌挥干，干法上样。

1.3.2 洗脱 先向层析柱中加入石油醚（二类）或正己烷进行润柱，再用配好的洗脱剂（由石油醚、正己烷及乙酸乙酯配制成一定密度的溶劑）冲柱，洗脱剂密度单位增加量为0.005 g/mL，洗脱过程中采用薄板层析（TLC）进行检测。

1.3.3 收集 当点板显色后样品点与6-姜酚标准品点水平位置重叠或平行时，开始收集。当样品点变小、颜色变得很浅时，表明6-姜酚组分已基本全冲出，停止收集接液。

1.3.4 溶剂回收及样品干燥 将冲柱后的洗脱剂进行旋转蒸发回收溶剂，回收的溶剂可重复利用。含6-姜酚的收集液回收完溶剂后，放入40 ℃、0.08 MPa的真空干燥箱中干燥，用HPLC测定样品中6-姜酚的含量。

1.4 检测分析

1.4.1 高效液相色谱条件 Agilent高效液相色谱仪，色谱柱：迪马Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 m）；乙腈-水（V/V=70∶30）为流动相；流速1.0 mL/min；检测波长为280 nm，柱温30 ℃，进样量10 L。

1.4.2 标准曲线的绘制 精密称取6-姜酚标准品20.30 mg，以色谱纯甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶作标准品溶液。分别精确移取适量标准品溶液于6个10 mL容量瓶内，用甲醇稀释至6个不同浓度水平的系列标准品溶液。各标准品溶液分别进样 10 μL，重复进样3次，计算峰面积平均值，以峰面积平均值为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线计算回归方程。最终得到回归方程y=5 511.646 73x-17.16（R=0.999 99），结果表明6-姜酚在0.081 2～0.487 2 mg/mL呈良好的线性关系。

2 结果与分析

2.1 洗脱剂的选择

以300～400目硅胶为填料，采用干法装柱，在填料比（填料质量与样品质量的比值）为40，冲柱时间为3～4 d，考察不同种类洗脱剂对6-姜酚含量及收率的影响（表1）。结果表明，以正己烷和乙酸乙酯、石油醚和乙酸乙酯、石油醚和正己烷及乙酸乙酯配制的溶剂作洗脱剂进行减压梯度过柱分离，获得的分离物中6-姜酚含量在83%左右，收率在92%左右，3种洗脱剂的分离效果差异不明显。

2.2 填料比的选择

以300～400目硅胶为填料，干法装柱及上样，以石油醚和正己烷及乙酸乙酯配制成洗脱剂，梯度范围为0.670～0.710 g/mL，考察填料比对6-姜酚含量及收率的影响（图1）。由图1可知，随着填料比的增加，纯化物中6-姜酚含量随之增加，6-姜酚收率是先增加后减小。这是因为填料比增加，6-姜酚组分与杂质的分离度增大，所以纯化物中6-姜酚含量增大。但填料增加，硅胶中6-姜酚的吸附量增加，导致纯化物中6-姜酚收率降低。当填料比为100时，纯化分离物中6-姜酚的含量大于91%，收率大于92%，分离效果较好。

2.3 洗脱剂起始浓度

以300～400目硅胶为填料，填料比为100，以石油醚和正己烷及乙酸乙酯配制成不同密度的洗脱剂，从开始更换梯度洗脱剂到6-姜酚冲完（TLC结果样品点没有6-姜酚）截止，考察洗脱剂密度梯度对洗脱剂用量的影响（图2）。由图2可知，随着洗脱剂起始浓度（即密度）增加，6-姜酚含量先增加后降低，而收率是先降低再增加。当洗脱剂起始浓度分别大于0.695 g/mL和0.725 g/mL时，虽然6-姜酚收率增大，但含量下降较大。这是由于洗脱剂密度增大极性增强，弱极性杂质与6-姜酚不能有效分离，导致含量降低收率升高。当洗脱剂起始浓度为0.695～0.725 g/mL时（洗脱剂密度增量为0.005 g/mL），6-姜酚含量最高，收率为90%左右，说明该洗脱剂浓度对6-姜酚的分离效果好。

2.4 填料目数

以300～400目普通精制硅胶作填料时，洗脱剂流经柱子时阻力过大，真空度在0.07～0.08 MPa，真空泵压力較大，洗脱剂流速较低。因此，以100～200、200～400和300～400目硅胶为填料，石油醚和正己烷及乙酸乙酯配为洗脱剂，研究硅胶目数对6-姜酚分离效果的影响（表2）。由表2可看出，随着填料颗粒目数减小，冲柱时间变短。这是因为填料目数变小，粒径变大，填料间缝隙变大，孔道变多，洗脱剂流经柱子时阻力减小，流速加快，冲柱时间就减小。以100～200、200～300目硅胶为填料时，冲柱后获得的纯化物中6-姜酚收率虽然比较高，分别为95.23%和93.22%，但含量较低，均低于90%。当填料目数为300～400目时，过柱所得纯化物中6-姜酚含量较高，为93.04%，但收率较低，仅为83.11%，这可能是由于起始接液点过晚，部分6-姜酚从柱内冲出但未及时收集，导致6-姜酚收率降低，说明硅胶目数越大，越有利于6-姜酚含量的提高。

3 结论

硅胶柱层析分离纯化6-姜酚试验中，洗脱剂种类对分离效果影响较小，增加了洗脱剂的选择性，并可进行自由组合；其次，填料比增大有利于6-姜酚含量的提高，但收率会有所降低，洗脱时间会增加。洗脱剂起始浓度对6-姜酚的分离效果也有较大影响，选择合适的洗脱剂起始浓度，可获得较高的6-姜酚含量及收率。

层析柱规格为60 mm×1 200 mm，300～400目硅胶为填料，填料比为100，石油醚、正己烷及乙酸乙酯配制成密度为0.695～0.725 g/mL的洗脱剂，单位增量为0.005 g/mL。在此工艺参数下进行减压梯度柱层析分离纯化6-姜酚，可将其含量从55.03%提高到93%左右，收率在83%以上。

致谢：感谢贵州百灵制药技术中心为试验研究提供的帮助和支持。

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