辣木叶总黄酮对酪氨酸酶的抑制及抗氧化活性研究

姚小丽，张素中，魏洁书，张善添

（中山大学新华学院药学系，广东广州510520）

辣木叶总黄酮对酪氨酸酶的抑制及抗氧化活性研究

姚小丽，张素中＊，魏洁书，张善添

（中山大学新华学院药学系，广东广州510520）

本文采用DPPH法及酪氨酸酶对L-多巴转化活性影响测定法对辣木叶总黄酮的粗提物进行生物活性测试，评价其抗氧化性及对酪氨酸酶的抑制效果。结果表明辣木叶总黄酮的粗提物具一定的抗氧化性，对DPPH消除率IC50为0.0022mg/mL，辣木叶总黄酮粗提物对酪氨酸酶的抑制率IC50为335μg/mL，对酪氨酸酶的抑制作用为随着浓度增大而增大。辣木叶总黄酮粗提物具抗衰老及祛斑美白功效，在美容方面有潜在的应用价值。

辣木叶；总黄酮；抗氧化性；酪氨酸酶；抑制

随着年龄的增加，机体保护机制逐渐下降。体内生理性损伤，特别是脂质过氧反应，即内源性超氧自由基作用于机体中的不饱和脂肪酸，产生不稳定的过氧化脂质，进而分解产生丙二醛等醛类，它通过攻击磷脂和蛋白质，反应生成脂质蛋白复合物，脂褐素沉积于细胞内，成为细胞老化的标志。因此，抗氧化一直是预防和治疗皮肤老化的有力手段，也是其他许多化合物达到抗皮肤老化作用的重要途径。相关研究表明，黄酮类物质有较强的抗氧化性，提示了黄酮类物质有一定的抗皮肤老化作用效果[1]。

污染严重对人的肌肤造成很大影响，包括肤色变黄、暗淡，皮肤老化、没有光泽等，严重甚至出现色斑。黑色素是影响皮肤的主要因素，酪氨酸酶是机体合成黑色素的主要酶，抑制酪氨酸酶活性可以减少机体黑色素的形成，达到一定的美白袪斑效果[2]。根据相关研究表明，黄酮类物质对酪氨酸酶的活性有比较强的抑制作用，说明黄酮类物质有一定的美白祛斑效果。

本研究通过测试辣木叶中总黄酮粗提取的生物活性，为辣木植物资源的开发提供科学依据，也为从中筛选出美白祛斑抗老化的天然护肤品提供了有力依据。

1 实验材料

1.1 仪器

pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司，型号：PHS-3S）、酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司，型号：Multiskan FC型）、紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司，型号：UV6000）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 材料与试剂

辣木叶，为辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa）辣木Moringa oleifera Lam，引种印度辣木，中山大学新华学院药圃园自种。

酪氨酸酶（江莱生物，批号：JL161014004）、曲酸（上海谷研实业有限公司，批号：Y151225A）、L-多巴（江莱生物，批号：JL160519015）、DPPH（江莱生物，批号：JL161020021）、维生素C对照品（江莱生物，批号：JL160915005）、芦丁对照品（酷尔生物，批号：B154199）。

2 实验方法

2.1 辣木叶总黄酮的粗提物的制备

将新鲜的辣木叶洗净，于60℃烘干，粉碎成粗粉备用。取辣木叶粗粉10g，加入70%乙醇，物料比为1∶10，提取温度为52℃，提取时间为40min，提取液过滤，将滤液减压真空浓缩至50mL，得辣木叶总黄酮的粗提取物（总黄酮含量为427mg/mL），作为待测物。

2.2 辣木叶总黄酮的粗提物的生物活性测定

2.2.1 抗氧化性[3][4]

检测液的配制：用无水乙醇分别配制成0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.009mg/mL和0.010mg/mL浓度的辣木总黄酮的待测液。

对照液的配制：精密称取维生素C对照品0.100mg，用无水乙醇定容至10mL。再分别用无水乙醇配制成0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.009mg/mL和0.010mg/mL浓度的维生素C对照液。

测定：取上述待测液或对照液2mL，分别加入2mL的DPPH溶液，摇匀，室温下暗处静置30min后测定其吸光度A样品，同时测定2mL DPPH溶液与2mL无水乙醇混合后的吸光度A空白，以及2mL测试样品溶液与2mL无水乙醇混合后的吸光度A空白。以上数据均以无水乙醇为空白对照测量吸光度。分别计算维生素C和辣木总黄酮对DPPH的清除率S。

2.2.2 对酪氨酸酶的抑制作用[5][6]

酪氨酸酶的活力的测定：以0.5mmol/L L-多巴为底物，以曲酸为对照品，取曲酸配制成70、80、90、100、110、120μg/mL和130μg/mL浓度的系列对照品溶液；将辣木总黄酮提取物配制成200、250、300、350、400、450μg/mL和500μg/mL浓度的系列样品溶液；将酪氨酸酶配制成浓度为6.67μg/mL的溶液。（注：L-多巴溶液、酶溶液及样品溶液均以50mmol/L磷酸缓冲液（pH=6.8）配制）。按表1组成进行试验，试验的条件为混匀后在37℃水浴保温30min，按照每组反应时间为1min用酶标仪进行测定，检测波长为475nm，记录吸光度A，并计算抑制率（%）。

公式（2）中，A1：未加样品的加酶混合液所测的吸光度；A2：未加样品和酶的混合液所测的吸光度；A3：加样品和酶的混合液所测的吸光度；A4：加样品而未加酶的混合液所测的吸光度。

表1 各组反应液组成

3 实验结果

3.1 抗氧化性的测定

由图1可知，维生素C浓度大于0.008mg/mL后清除率增加缓慢并趋于平稳，由图2可知，总黄酮提取物浓度大于0.004mg/mL后清除率增加缓慢并趋于平稳。对比图1与图2可知，图2曲线更陡更快趋于平稳，再比较维生素C和辣木总黄酮的IC50，维生素C为0.006 6mg/mL，辣木总黄酮为0.0 022mg/mL，表明辣木总黄酮的对DPPH清除率更好、抗氧化能力更强。

图1 维生素C对DPPH的清除率曲线

图2 辣木总黄酮对DPPH的清除率曲线

3.2 对酪氨酸酶抑制的作用

由图3可知，曲酸对酪氨酸酶的抑制作用随着曲酸的浓度增大而增大，对酪氨酸酶IC50为70μg/mL。由图4可知，辣木总黄酮对酪氨酸酶的抑制作用为随着浓度增大而增大，对酪氨酸酶IC50为335μg/mL。可见，辣木总黄酮的作用还是相当明显的，其对酪氨酸酶的抑制机制作用与曲酸相似。

图3 不同浓度曲酸对酪氨酸酶抑制率曲线

图4 不同浓度辣木总黄酮对酪氨酸酶抑制率曲线

4 讨论

酪氨酸酶是生物合成黑色素细胞的主要限速酶。酪氨酸酶活性增加，产生的黑色素就会更多；活性被抑制，黑色素细胞产生黑色素的能力就相应降低。目前市场上美白药物主要是通过抑制酪氨酸酶活性达到美白效果。内源性超氧自由基作用于机体中的不饱和脂肪酸，产生不稳定的过氧化脂质，进而分解产生醛类，它通过攻击磷脂和蛋白质，反应形成脂质蛋白复合物，使脂褐素沉积于细胞内，成为细胞老化的标志。抗氧化是其他许多化合物达到抗皮肤老化作用的重要途径。

通过前期的研究，发现辣木叶中总黄酮的含量达4.27%以上，具有很高的开发价值。本实验发现，辣木总黄酮的抗氧化性及对酪氨酸酶的抑制作用较佳。其中辣木叶总黄酮和维生素C的IC50相比较，维生素C为0.0 066mg/mL，辣木叶总黄酮为0.0 022mg/mL，提示辣木总黄酮对DPPH清除率更好、抗氧化能力更强；辣木总黄酮对酪氨酸酶的活性存在一定的抑制作用，且随着浓度增大而增大，对酶的抑制作用显著增强，对酪氨酸酶IC50为335μg/mL。可见，辣木总黄酮的作用还是相当明显的。

综上所述，辣木叶总黄酮具有美白祛斑、抗衰老作用，因此，从辣木叶中提取总黄酮作为美白祛斑、抗衰老成分，既符合当前以天然药物为美容成分的发展趋势，也为辣木的运用开发相关产业提供了科学依据。

[1]唐津忠,鲁晓翔,陈瑞芳.金莲花中黄酮类化合物的提取及其抗氧化性研究[J].食品科学,2003(6):88-91.

[2]万明,宋永钢,杨菠.黄酮类化合物的药理作用及其在食品工业中的应用[J].江西食品工业,2007(3):47-49.

[3]韦献雅,殷丽琴,钟成,等.DPPH法评价抗氧化活性研究进展[J].食品科学,2014(9):317-322.

[4]缪成贵,陈庆榆,何华奇.采用DPPH法测定四大药用名菊抗氧化活性[J].安徽科技学院学报,2012(4):39-42.

[5]曹伟伟,朱晓娜,李明静.几种天然植物提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用[J].化学研究,2013(3):288-292.

[6]刘英华,欧阳红,徐庆,等.桑叶提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用[J].中国临床康复,2005(3):164-165.

Inhibitory and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Leaves of Moringa Oleiferaon Tyrosinase

Yao Xiao-li，Zhang Su-zhong*，Wei Jie-shu，Zhang Shan-tian
(Department of pharmacy,Xinhua College of Sun Yat-sen University，Guangdong Guangzhou 510520)

In this paper,using the method of DPPH and tyrosinase conversion activity effect on L- DOPA determination of total flavonoids from leaves of Moringa oleifera extracts were tested for biological activity,evaluate its antioxidant activity and inhibitory effect on tyrosinase.The results showed that the total flavonoids from leaves of Moringa oleifera extract has antioxidant properties,the DPPH elimination rate of IC50was 0.0022mg/mL,inhibition of total flavonoids of Moringa oleifera extracts on tyrosinase rate of IC50was 335 μg/mL,inhibition of tyrosinase was increased with the increase of the concentration of.Total flavonoids of Moringa oleifera extracts with anti-aging and whitening effect,and has potential application value in beauty.

Moleifera;Total flavonoids;Antioxidation;Tyrosinase;Inhibition

R284

A

2096-0387（2017）05-0023-03

大学生创新创业训练计划项目（2015CX013）。

姚小丽（1992—），女，广东吴川人，本科，助理实验师，研究方向：药剂药分。

张素中（1969—），女，广东梅州人，硕士，高级工程师，研究方向：中药新药药制剂及质量标准。