皂角苷强化白腐真菌Phlebia brevispora降解林丹的研究

肖鹏飞，KONDO Ryuichiro

(1.东北林业大学林学院, 黑龙江 哈尔滨 150040; 2.九州大学农学院, 日本 福冈 8128581)

皂角苷强化白腐真菌Phlebiabrevispora降解林丹的研究

肖鹏飞1，KONDO Ryuichiro2

(1.东北林业大学林学院, 黑龙江 哈尔滨 150040; 2.九州大学农学院, 日本 福冈 8128581)

【目的】为了提高环境中持久性有机氯农药的生物降解效果。【方法】利用平衡振荡法研究了生物表面活性剂皂角苷对有机氯农药林丹的增溶作用，并通过液相培养法研究了皂角苷对白腐真菌Phlebiabrevispora生长以及降解林丹的强化效果。【结果】皂角苷能大幅度增加林丹的溶解度，实验浓度范围内增溶倍数最高可达到7.4。皂角苷作为生长基质可促进P.brevispora的生长，提高其生物量，但浓度在达到1.0 g/L时，菌株生物量几乎不再继续增加。在0.05～1.0 g/L浓度范围内，皂角苷能显著提高菌株对溶液中林丹的降解效果(P<0.05)，且降解率随着皂角苷浓度的增加而增加，降解率最大可提高14.1 %。添加0.5和1.0 g/L的皂角苷处理时，菌株胞内粗酶液对林丹的降解率显著高于不添加皂角苷的处理(P<0.05)。皂角苷对林丹的增溶效果随着无机盐的加入而提高，20 mmol/L的NaCl和Na2SO4使林丹的溶解度提高了1.17和1.26倍； 而在含有皂角苷的降解体系中，NaCl的添加进一步促进了林丹的生物降解效果，降解率提高了10 %以上。【结论】本研究结果表明，利用皂角苷强化微生物降解去除环境中的有机污染物是可行的，具有一定的实际应用价值。

皂角苷; 林丹; 增溶作用; 白腐真菌; 生物降解; 胞内酶

【研究意义】我国于1952年开始生产有机氯农药六六六(Hexachlorocyclohexane，HCH)并被广泛使用于农业病虫害防治。截止至1998年，我国六六六的累计用量达到446万t，几乎占全球使用量的一半[1]。六六六在我国被禁用多年，但仍有较高的环境残留[2]，并可通过食物链、呼吸及皮肤接触等途径进入人体并产生毒害作用。据估计，2004年包括河北、北京、天津和山东部分地区在内的30万km2区域内，表土中六六六残留储量达(430±110) t，且大部分地区的表土已从禁用前的汇转变为二次污染源[3]。2009年，六六六的三种同分异构体α-HCH、β-HCH与γ-HCH(林丹)被增补列入《斯德哥尔摩公约》中的受控的持久性有机污染物名单中。可见，有效去除环境中残留的六六六类农药，对于保护粮食安全和人群健康尤为重要。【前人研究热点】作为六六六中唯一具有杀虫效果的林丹，化学性质稳定、亲脂性强、难以生物降解，环境残留期长。近年来国内学者在林丹降解菌的分离筛选、工程菌构建、酶促降解及土壤生物修复等方面开展了一些研究工作[4-7]。但林丹疏水性强，在土壤中与土壤颗粒结合紧密，在实际应用过程中存在微生物利用效率低的问题，因此如何提高林丹的水溶解度和生物可利用性是解决生物修复效率问题的关键因素。表面活性剂由于其特殊的分子结构特点，具有亲水、亲油双重特性，可通过胶束对疏水性有机污染物产生增溶效果，从而提高其生物可利用性，以达到强化生物修复效率的目的。目前该技术研究中多使用化学表面活性剂，其存在成本较高，用量大，容易对环境造成二次污染等问题。相比于化学表面活性剂，生物表面活性剂除了增溶效果好、用量少、成本低廉等特点外，还具有无毒、生物降解性好、无二次污染风险等一般化学表面活性剂不具备的特点[8]。【本研究切入点】目前研究中受关注最多的生物表面活性剂是鼠李糖脂，而其它生物表面活性剂研究很少。皂角苷广泛存在于植物中，它是以多环式化合物为配基的配糖体的总称，具有良好的乳化、分散及增溶等性能，是一种优良的天然表面活性剂，而且皂角苷从植物提取和分离较为容易，已广泛用于医药和日用化工等方面[8-9]。【拟解决的关键问题】作者前期研究了白腐真菌对一些持久性有机氯农药的降解特性，但在降解效率等方面仍存在一定的制约[7,10]。因此，本文在前期研究的基础上，拟进一步考察生物表面活性剂皂角苷对林丹的增溶效果，以及对菌株及其酶系降解水溶液中林丹的强化机制，探讨皂角苷应用在有机物污染治理中的可行性，为完善有机污染土壤的修复技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

林丹(98.6 %)购于Dr. Ehrenstorfer公司。皂角苷(98 %)购自上海易利生物科技有限公司。PDA培养基和PDB培养基购于北京奥博星生物技术有限责任公司。其它试剂均为国产分析纯。主要仪器有KQ-250VDB型双频数控超声波清洗器(昆山超声仪器)、HNY-1102C气浴恒温振荡仪(天津欧诺)、超声波细胞破碎机(上海生析)、H1650台式高速离心机(湖南湘仪)、旋转蒸发仪(上海亚荣)、HP6890-5973型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent)等。

1.2 菌株培养

将冷藏保存的白腐真菌PhlebiabrevisporaTMIC34596转移接种至PDA固体培养基表面，30 ℃静置培养至菌丝布满培养基表面。将菌丝体刮下转移至无菌水中，轻轻振荡形成白色的孢子悬浮液。取少量菌悬液接种于装有PDB液体培养基的大锥形瓶中，在30 ℃、150 r/min条件下活化培养。培养3～5 d后用平板计数法测定孢子数，当孢子数达到106个/mL以上时进行降解试验。

1.3 胞内酶的提取方法

取一定量已经活化好的种子液，在5000 r/min条件下离心10 min，过滤后将菌丝体用pH 7.5的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤2次。再加入适量的缓冲液后，冰浴条件下细胞破碎处理20 min(破碎30 s后间歇30 s)，12 000 r/min离心10 min后，收集液相部分即为胞内粗酶液。

1.4 试验方法

1.4.1 增溶实验 采用批量平衡振荡法，用去离子水配制不同浓度的皂角苷溶液，取20 mL溶液加入到锥形瓶中，添加稍过量的林丹粉末，盖塞后置于超声波清洗器中超声溶解30 min。取出锥形瓶并放入空气浴恒温振荡器中120 r/min、25 ℃振荡12 h使溶解达到平衡。取出锥形瓶并将溶液转移至离心管，为分离未溶解的林丹，6000 r/min下离心10 min。取适量上清液用等体积的乙酸乙酯萃取3次。萃取相合并后，用无水硫酸钠脱水干燥，旋转蒸发仪浓缩至微量，待测。

1.4.2 生长影响实验 在锥形瓶中加入20 mL灭菌的PDB液体培养基和一定量的皂角苷溶液，使其浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 g/L，再接种2 mL的白腐菌种子液，摇匀，30 ℃静置培养，定时取样。采用菌丝干重法测定生物量，通过离心、过滤得到的菌丝体，用清水反复洗涤，然后置于105 ℃下烘干至恒重称量。

1.4.3 菌株降解实验 配制一定浓度的林丹丙酮溶液并加入到锥形瓶，将其置于通风厨中使溶剂挥发。将PDB液体培养基高温灭菌后取20 mL加入锥形瓶，并接种2 mL活化好的菌株种子液。取适量的皂角苷溶液加入锥形瓶，液相中林丹的初始浓度为50 μmol/L。将锥形瓶摇匀，充氧30 s后盖塞。将锥形瓶放置于30 ℃培养箱中静置培养，定时取样。对照处理中将菌株种子液高温灭菌(121 ℃、20 min)处理后按同样方法进行。取出锥形瓶后，将样品转入离心管，使用高速匀质机将菌块均匀化后，3000 r/min、10 min离心处理，取出上清液，用等体积的乙酸乙酯萃取，脱水、浓缩至微量，待测。

1.4.4 菌株胞内酶降解实验 取适量林丹的丙酮溶液移入反应瓶，待溶剂挥发后加入磷酸盐缓冲液(pH 6.0)以及皂角苷溶液，将反应瓶置于30 ℃水浴锅预热10 min，然后加入1.0 mL的胞内粗酶液，反应液总体积为10 mL。反应体系中林丹的初始浓度为50 μmol/L。30 ℃、100 r/min条件下反应2 h后取出，用三氯醋酸终止反应。将培养液用20 mL乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后经无水硫酸钠脱水、浓缩至微量，待测。设加入高温(121 ℃、20 min)失活的酶液作对照组。

1.5 分析条件

气相色谱柱为DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。载气为高纯氦气，流量为1 mL/min。进样口温度250 ℃，不分流进样，进样量1 μl。升温程序为：起始温度80 ℃，保持3 min后以20 ℃/min升至300 ℃并保持2 min。采用内标准法定量。本研究中每个处理均做3个重复。

2 结果与分析

2.1 皂角苷对林丹的增溶效果

如图1所示，在低浓度(0.05和0.1 g/L)皂角苷溶液中，林丹的溶解度相比于水溶解度(7.9 mg/L)虽略有增加但并不明显；而当皂角苷浓度大于其临界胶束浓度(CMC，0.145 g/L)时，林丹的溶解度显著升高。在0.4 g/L的皂角苷溶液中，林丹的溶解度达到27.4 mg/L，随着皂角苷浓度的增加，林丹的溶解度也呈线性增加，在1.0 g/L的皂角苷溶液中，林丹的溶解度达到58.3 mg/L，相比于水溶解度提升了7.4倍。这是由于皂角苷浓度达到CMC值以上时产生了大量的胶束，林丹分子被分配到胶束分子中从而产生了增溶现象，使其溶解度大幅度提高。吴应琴等[8]研究了皂角苷对多环芳烃蒽的增溶作用，发现无论是CMC值以下还是以上，皂角苷对蒽都具有一定的增溶效果，当皂角苷浓度为0.6 g/L时，对蒽的增溶率比非离子表面活性剂TritonX100高出54.91 %。而杨娟娟等[9]同样以皂角苷为增溶剂研究了对芘的增溶效果，发现当皂角苷浓度为0.4 g/L时，芘的表观溶解度为17.4 mg/L，是水溶解度的133倍，增溶效果同样高于非离子表面活性剂。

图1 林丹在皂角苷溶液中的溶解度Fig.1 Water solubility of γ-HCH in saponin solutions

2.2 皂角苷对P. brevispora生长的影响

一些表面活性剂生物降解性好，可被微生物作为碳源利用而提高微生物的生长和代谢活性；而有些表面活性剂在一定浓度下会对降解菌产生毒性，使其数量和活性下降。因此，在污染物的生物处理过程中，选择合适的表面活性剂类型及浓度对于提高处理效率至关重要。由图2可知，在未添加皂角苷的对照处理中，菌株在经过前期的适应阶段后生物量随时间的延长迅速提高，至第8天后菌丝干重达到2.54 g/L，之后由于培养基的消耗，其生物量变化不大。在不同浓度的皂角苷溶液中，除第2天与对照处理在生物量没有明显差异外，第4天之后的不同浓度处理与对照相比均有不同程度的提高，尤其在高浓度处理中的生物量显著高于对照和低浓度处理(P<0.05，下同)。如在0.5 g/L的皂角苷溶液中，培养4 d后的生物量不仅比对照处理均提高了20 %以上，表明适当提高皂角苷浓度有利于提高菌株的生长。但在1.0 g/L的皂角苷溶液中，菌株生物量相比于0.5 g/L的浓度处理并没有明显提高。该结果与一些学者报道的生物表面活性剂对微生物生长的影响效果一致[10-12]。王芳芳等[11]研究发现皂角苷在0.01～0.2 g/L浓度范围内，可作为苏云金芽孢杆菌的碳源对其生长起促进作用，而0.5 g/L的皂角苷则会不利于菌株的生长。本研究结果表明，皂角苷在一定的浓度范围(0～0.5 g/L)内会促进菌株的生长和繁殖速度，提高其生物量，但浓度进一步提高对菌株生长没有明显的促进效果。

不同字母表示各处理间差异显著(P<0.05)Different letter indicate significant difference (P<0.05)图2 P. brevispora在含不同浓度皂角苷的培养基中的生物量Fig.2 The biomass of P. brevispora on medium with saponin at different concentration

2.3 皂角苷对P. brevispora降解林丹的影响

如图3所示。在未加皂角苷的对照处理中，菌株对林丹显示出一定的降解效果，且随着培养时间的延长降解率逐渐增加，在处理18 d后降解率可达到72.3 %。而在添加皂角苷处理中，林丹的降解率相比于对照处理均发生了不同程度的变化。在降解开始后的第3和6天，几乎所有浓度梯度的皂角苷溶液中，林丹的降解率均显著高于对照处理。可见皂角苷的添加明显促进了P.brevispora对水溶液中林丹的降解效果。同时随着处理时间的增加，不同浓度皂角苷处理间林丹降解率的差异也逐渐显现出来，且呈现出皂角苷浓度越高，林丹降解率越大的趋势。如处理12、15和18 d，1.0 g/L的皂角苷溶液中林丹的降解率均达到同时期处理中最高，分别为57.6 %、75.8 %和86.4 %，分别比对照提高了10.0 %、12.3 %和14.1 %，同时也显著高于低浓度(0.05～0.2 g/L)皂角苷溶液中的林丹降解率。

本研究中，当皂角苷浓度低于0.1 g/L时，由于没达到其CMC值(0.145 g/L)，胶束生成量较少，增溶作用并不是强化降解率的主要因素，但可作为生长基质刺激菌株的生长代谢活性[12]。还有研究指出一些表面活性剂可在较低浓度时改变细胞膜通透性，提高酶活力和催化能力[13]。当皂角苷浓度高于CMC值时，胶束的大量生成对林丹起到较好的增溶作用，增加了林丹与降解菌的接触机会，使林丹的生物可降解性增加。即使在对菌株的生长开始产生抑制作用的高浓度(1.0 g/L)的皂角苷溶液中，林丹的降解率相比于0.5 g/L的皂角苷添加体系仍有增加。可见，皂角苷强化林丹的降解机制包括增加林丹的生物可利用性和影响菌株生理活性两方面的综合结果。

2.4 皂角苷对P. brevispora胞内粗酶液降解林丹的影响

前期研究已经证实，P.brevispora对林丹的降解是胞内酶和胞外酶共同催化完成的，但胞内酶降解占主导作用[7]，因此本研究进一步考察了皂角苷对胞内粗酶液降解林丹的促进效果。由图4可见，林丹的降解率的变化与酶降解时间及皂角苷浓度有关。在酶处理30 min后，虽然添加皂角苷处理时降解率略有增加但与对照相比并不显著；在60 min时，添加1.0 g/L的皂角苷处理中林丹降解率显著高于对照和0.5 g/L浓度处理；在90 min时，添加皂角苷处理中的林丹降解率显著高于对照处理；在120 min时，各浓度处理之间的降解率均呈现显著差异，此时1.0 g/L的皂角苷溶液中林丹降解率比对照和0.5 g/L浓度处理分别提高了10.0 %和4.8 %，达到了70.2 %。可见林丹通过皂角苷的增溶作用增加了和降解酶的接触，从而增加了降解效率。本结果发现，处理时间越长，皂角苷对林丹酶促降解的强化效果越好，这可能与增溶的平衡时间有关。在增溶作用达到平衡之前，振荡处理时间越长，通过增溶作用进入液相的林丹分子越多，酶降解率就越高。

图3 皂角苷对P. brevispora降解林丹的影响Fig.3 Effects of saponin on degradation of γ-HCH by P. brevispora

2.5 无机盐对增溶作用及生物降解的影响

以NaCl和Na2SO4为例研究不同浓度的无机盐对1.0 g/L的皂角苷增溶林丹的影响。如图5所示，在添加较低浓度的无机盐时，林丹的溶解度即可大幅提高。当NaCl和Na2SO4浓度为10 mmol/L时，林丹溶解度从58.3 mg/L分别提高到66.0和69.4 mg/L，随着无机盐浓度的继续升高，林丹溶解度仍呈现继续增加的趋势，当NaCl和Na2SO4浓度达到20 mmol/L时，林丹溶解度分别增加到68.3和73.2 mg/L，分别提高了1.17和1.26倍。王欢等[14]、郭利果[15]等均发现钠盐在较低浓度下即对多环芳烃的增溶有较强的促进效应。皂角苷是非离子型表面活性剂，一般认为，无机盐通过对疏水基的盐析作用，降低非离子表面活性剂的浊点，降低其CMC值，增加胶束聚集数，从而缔合成更大的胶束。还有研究认为，皂角苷分子中含有部分带电基团(羧基等)，金属离子强度的增大可减弱皂角苷分子间的静电排斥作用，降低皂角苷溶液的CMC值，增大皂角苷的增溶能力[8]。有研究已经证实当NaCl浓度从0.01 mol/L增大到1.0 mol/L时, 皂角苷溶液CMC值由约50.0 mg/L降低到约8.6 mg/L[16]。

图4 皂角苷对胞内粗酶液降解林丹的影响Fig.4 Effects of saponin on degradation of γ-HCH by intracellular enzyme from P. brevispora

图5 无机盐对皂角苷增溶林丹的影响Fig.5 Effects of inorganic salts on solubilization of γ-HCH by saponin

基于以上结果，设定皂角苷浓度为0.5 g/L，将不同浓度的NaCl加入菌株降解体系，拟进一步探讨无机盐对皂角苷强化菌株降解林丹的影响。如图6所示，降解第3天，添加高浓度(6～10 mmol/L)NaCl处理中的降解率显著高于对照和低浓度处理(2～4 mmol/L)；而降解第6天之后不同处理间的降解率差异更加明显，高浓度处理显著高于低浓度处理，低浓度处理又显著高于对照处理。如添加10 mmol/L的NaCl处理中林丹的15 d降解率为85.1 %，显著高于浓度为2 mmol/L时的降解率79.9 %和对照处理的降解率74.6 %。即在本试验浓度范围内，呈现出NaCl浓度越高，林丹生物降解率越高的规律。如前文所述，无机盐的添加可降低皂角苷的CMC值，增大皂角苷增溶林丹的能力，使其生物可降解性进一步增加，从而提高了降解率。此外，金属离子还可以提高白腐真菌的生物降解活性。何宝燕等[17]研究发现Fe2+等金属离子在一定浓度范围内可促进白腐真菌黄孢原毛平革菌对十溴联苯醚的降解，并一定程度提高菌株分泌的胞外酶的活力。卢永等[18]也报道了Cu2+等金属离子对黄孢原毛平革菌降解苯酚有明显的强化效果，缩短苯酚降解时间。

3 结 论

(1)在0～1.0 g/L浓度范围内，皂角苷可有效增加林丹的溶解度，且增溶效果随皂角苷浓度的增加而显著增加；在1.0 g/L的皂角苷溶液中，林丹的溶解度相比于水溶解度提升了7.4倍。0～0.5 g/L的皂角苷可促进菌株P.brevispora的生长繁殖，增加其生物量；但浓度继续升高至1.0 g/L时，菌株的生长受到一定程度的影响，生物量几乎不再继续增加。

图6 无机盐对P. brevispora降解林丹的影响Fig.6 Effects of inorganic salts on degradation of γ-HCH by P. brevispora

(2) 皂角苷可通过对林丹的增溶和对菌株生长的促进作用影响P.brevispora对林丹的降解效果。高浓度的皂角苷更有利于菌株对林丹的降解，相比于对照处理，当皂角苷浓度为1.0 g/L时的林丹降解率最高可增加14.1 %。林丹经菌株胞内粗酶液降解60 min后，0.5和1.0 g/L的皂角苷同样能显著提高林丹的酶促降解效果，相比于对照处理，降解率最高可提高10 %。

(3) 无机盐的加入可提高皂角苷的增溶能力，20 mmol/L的NaCl和Na2SO4使林丹的溶解度相比于不添加无机盐处理分别提高了1.17和1.26倍。此外，NaCl的添加进一步提高了皂角苷对菌株降解林丹的强化效果，林丹降解率提高10 %以上。本研究结果表明，利用皂角苷强化白腐真菌降解去除环境中的有机污染物是可行的，具有一定的实际应用潜力。

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EnhancementofSaponinforBiodegradationofγ-HCHbyWhiteRotFungusPhlebiabrevispora

XIAO Peng-fei1, KONDO Ryuichiro2

(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Heilongjiang Harbin 150040, China; 2. Faculty of Agriculture, Kyushu University, Fukuoka 8128581，Japan )

【Objective】The present study was conducted to improve the effect on biodegradation of persistent organochlorine pesticides.【Method】The effects of biosurfactant saponin on solubilization of chlorinated pesticidesγ-HCH, and biodegradation ofγ-HCH by fungusPhlebiabrevisporawere investigated using balance vibration method and liquid culture method respectively. 【Result】The results of solubilization indicate that the solubility ofγ-HCH could be enhanced by saponin at 0.05-1.0 g/L. The fungal biomass ofP.brevisporawith saponin of high concentration were larger than that without saponin and that with saponin of low concentration. The saponin could significantly increase the degradation rate ofγ-HCH byP.brevisporaand the degradation efficiency increased with incresing saponin concentration. The highest efficiency was increased by 14.1 % compared to the control. It was also found that saponin at 0.5 and 1.0 g/L significantly increased degradation rate ofγ-HCH by intracellular enzyme fromP.brevispora, after 60 min of degradation. The solubility and biodegradation rate ofγ-HCH were enhanced by addition of inorganic salts including NaCl and Na2SO4of 20 mmol/L. 【Conclusion】The results confirmed the workability of saponin-white rot fungus augmented remediation of contaminated environments.

Saponin;γ-HCH; Solubilization;P.brevispora; Biodegradation; Intracellular enzyme

1001-4829(2017)5-1109-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.022

2016-06-24

国家自然科学基金项目(41201307)；教育部留学回国人员科研启动基金([2013]693)

肖鹏飞(1978-)，男，博士，副教授，主要从事有机物污染土壤的修复技术研究，E-mail:xpfawd@nefu.edu.cn。

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(责任编辑 李山云)