中药二仙汤对骨髓干细胞增值和迁移能力的影响

李 楠 艾 浩

1.锦州医科大学附属第三医院妇科(121000)；2.锦州医科大学附属第一医院妇科

·基础研究·

中药二仙汤对骨髓干细胞增值和迁移能力的影响

李 楠1艾 浩2*

1.锦州医科大学附属第三医院妇科(121000)；2.锦州医科大学附属第一医院妇科

目的：观察二仙汤对骨髓间充质干细胞增殖能力和迁移能力的影响，为二仙汤协同骨髓间充质干细胞治疗卵巢早衰提供基础实验依据。方法：分别将20只SD雌性大鼠制备含二仙汤的药物血清(含药组)和无药物血清(对照组)，取10只大鼠体外分离骨髓间充质干细胞进行培养，通过对照法对细胞形态学观察、MTT法测定、细胞周期及细胞迁移能力进行检测并分析。结果:与对照组相比，含药组细胞增殖能力和迁移能力均明显增强。结论：二仙汤协同骨髓干细胞自体移植治疗卵巢早衰疾病具有可行性。

骨髓间充质干细胞；二仙汤；增殖能力；迁移能力

干细胞移植作为一种新的治疗方法成为国内外学者研究的热点，且已在急性白血病、角膜移植等疾病治疗中取得成功。目前干细胞移植治疗卵巢早衰处于动物实验阶段，其也可能是一种治疗卵巢早衰最有希望的临床治疗方法[1-4]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种成体干细胞，具有多向分化潜能。有验研究证实BMSCs可向生殖细胞转化，能够修复受损卵巢和改善卵巢功能[5]。二仙汤可明显改善卵巢早衰的临床症状，促进卵泡发育成熟及排卵[6-7]。本研究对二仙汤提高自体移植的干细胞增值能力和迁移能力进行观察，为后续动物实验自体移植干细胞定向迁移至卵巢、改善衰竭卵巢的功能、以及临床治疗卵巢早衰提供基础依据。

1 资料与方法

1.1材料及试剂

生长8周的SD雌性大鼠50只(购自锦州医科大学动物实验中心)。DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、CD90单克隆抗体及同型对照抗体、CD34单克隆抗体及同型对照抗体(中文)、碘化丙啶染液(PI染液)均购自南京建成生物工程研究所。 二仙汤组方：仙茅10g、淫羊藿15g、巴戟天15g、知母10g、当归15g和黄柏10g。

1.2血清制备

含药组：取20只大鼠，给药剂量根据临床用药量及动物等效剂量系数，以4倍剂量灌胃给药，每次3ml(含生药量2.13g/ml)，2次/d，连续4d，在末次给药后1h采血，分离血清，56℃水浴灭活30min,无菌过滤分装，制备成20%含药血清培养基(10ml二仙汤血清、40ml DMEM培养基)。对照组：取20只大鼠，以等剂量、等时间的生理盐水灌胃，同样方法分离血清，制备成20%无药物血清培养基(10ml血清、40ml DMEM培养基)。另外取10只大鼠体外分离骨髓间充质干细胞进行培养。

1.3 BMSCs的分离、培养、纯化

将两组大鼠处死后浸泡于75%酒精，无菌条件下分离股骨，用含10%胎牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔，制备完成细胞悬液以3×105cell/ml接种于25cm2培养瓶内培养。首次半量换液于48 h，分别改用含药和非含药血清培养基，并标记，每3天全量换液。细胞80%铺于培养瓶时可进行传代培养(传代比例1:3)。观察细胞形态及生长状态变化。

1.4流式细胞仪检测细胞表面标记

第3代细胞生长状态良好、细胞密度1×105cell/ml时，磷酸缓冲液(PBS)重悬细胞，在各管细胞中，加入CD90、CD34单克隆抗体和其同型对照抗体。室温、避光孵育45 min，洗涤3次去未结合抗体，取重悬细胞进行流式细胞学检测分析。

1.5骨髓间充质干细胞(BMSCs)增值活性测定

使用第3代BMSCs，接种于96孔培养板观察细胞增值活性。每组设9个复孔，密度1×103/孔、150μl/孔，待细胞贴壁后，换含药血清和对照血清培养基。孵育48h， 取MTT 20μl放入各孔；培养4h后，弃上清，取DMSO溶液放入各孔，进行MTT检测，记录各孔光吸收值(OD)并对数值进行比较。

1.6流式细胞术检测细胞周期

调整细胞密度(5×105cell/ml)用于细胞周期检测，收集细胞置于预冷的乙醇中过夜。次日抽取200μl RNA酶于细胞内，水浴30min，再给予400μl PI染液30min，4℃避光，检测细胞周期判断BMSCs增殖能力。

1.7共培养体系

应用6孔细胞培养皿，将8um孔径的Transwell小室置入6孔板内组成共培养。取第3代BMSCs(浓度5×105/ml)置于半透膜上层，下室分别加入含药组和对照组血清，每组设5个复孔。孵育24h，吸出6孔板的培养基，90%酒精固定30min，0.1%结晶紫染色20min，PBS清洗后显微镜下观察细胞形态(随机取3个不同视野)，观察下室细胞并计数分析。

1.8统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料以例数或(%)表示，组间比较用χ2检验；P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞形态观察

原代细胞悬浮于培养液中，细胞于取材24h后贴壁。细胞明显增多，形态似梭形，可见细胞集落生长。消化传代后24h内完全贴壁生长。镜下观察培养的两组骨髓干细胞形态无明显差异，见图1。

图1 两组第三代干细胞形态(×100)

2.2 BMSCs的鉴定及增殖活性比较

干细胞的流式细胞仪检测CD90呈阳性、CD34呈阴性，提示体外培养的干细胞确定为BMSCs，见图2。含药组BMSCs的OD(0.61±0.11)高于对照组(0.75±0.12)(t=2.720,P=0.024)。

图2 细胞表面抗原CD90和CD34表达

2.3两组细胞周期比较

流式细胞仪分析结果显示，含药组S期和G2/M期百分比增加值高于与对照组(P<0.05)，见表1和图3。

2.4 BMCSs迁移

通过细胞计数统计分析，含药组的BMCSs迁移到下室细胞高于对照组(P<0.05)，见图4。

表1 两组细胞周期比较

图3 两组细胞生长周期比较

图4 两组 BMCSs迁移

3 讨论

干细胞能分化身体各个部位所需要的细胞，以往实验证明羊水细胞入卵巢早衰动物模型，1个月后发现其阻止卵泡闭锁，为卵巢早衰不孕患者提供了希望[1]。近来研究证明与单一干细胞移植相比，药物协同干细胞移植治疗卵巢早衰的疗效更为显著。二仙汤是疗效确凿的著名方剂，此方功效温肾阳，补肾精，是治疗妇科病症中运用广泛的方剂之一[6-7]。以往实验研究显示二仙汤可以通过上调卵泡颗粒细胞雌激素受体的表达，促进卵泡发育成熟和排卵[7]。本研究增值能力测定及共培养均显示了二仙汤能够提高干细胞的增值和迁移能力,为后续自体移植干细胞迁移至卵巢组织、提高干细胞的增值能力、改善卵巢功能等研究提供实验基础，也为该治疗方法运用于临床提供基础依据。

目前干细胞移植治疗卵巢早衰研究仍处于动物实验阶段，从研究进展来看中药联合干细胞治疗将成为中西医结合治疗的新观点[8-9]。综上所述，二仙汤可用于卵巢早衰的治疗，但仍需要进一步研究。

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EffectsofEr-xiandecoctiononproliferationandmigrationofbonemarrowstemcells

LI Nan, Ai Hao

1.TheDepartmentofGynaecology,TheThirdAffiliatedHospitalofJinZhouMedicalUniversity,JinZhou,Liaoning, 121000; 2.TheDepartmentofGynaecology,TheFrstAffiliatedHospitalofJinZhouMedicalUniversity

Objective: To observe the effects of the Er-xian decoction on the proliferation and migration of bone marrow stem cells (BMSCS), and to provides of experiment evidence to treat premature ovarian failure (POF) by BMSCS combined with Er-xian decoction. Methods: In the vitro experiment, 20 SD female rats were in experimental group, which were given Er-xian decoction, and another 20 SD female rats were in control group, which were given water only. All rats were used to prepare serum. Then BMSCs were isolate from 10 rat bone marrow. The cell morphology, MTT, cell cycle and cell migration were detected and compared between the two groups. Results: Compared to control group, Er-xian decoction raised cell proliferation and migration. Conclusion: This vitro experiment shows that er-xian decoction combined with BMSCs to treat POF is feasible.

Bone marrow stem cells; Erxian decoction; Proliferation; Migration

10.3969/j.issn.1004-8189.2017.07.003

2017-03-14

2017-04-07

[责任编辑：董 琳]