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蝙蝠葛碱在人乳腺癌MCF-7细胞对5氟尿嘧啶敏感性的研究

2017-11-07李红阳苑光军

实用肿瘤学杂志 2017年5期
关键词:阈下氟尿嘧啶蝙蝠

李红阳 孙 亮 姜 醒 苑光军 刘 艳

·基础研究·

蝙蝠葛碱在人乳腺癌MCF-7细胞对5氟尿嘧啶敏感性的研究

李红阳1孙 亮2姜 醒3苑光军3刘 艳1

目的探讨人乳腺癌MCF-7细胞受蝙蝠葛碱(Dauricine,Dau)作用后,对5氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的影响。方法分别以终浓度为2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱、50 μg/mL的5-FU、2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱和50 μg/mL的5-FU作用于人乳腺癌细胞MCF-7,运用MTT法检测细胞增殖活性,Transwell实验分析细胞的迁移,DAPI染色检测细胞的凋亡,Western blot法检测cyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。结果MTT实验结果显示联合使用阈下浓度的蝙蝠葛碱增强了5-FU对细胞增殖的抑制;Transwell实验表明联合应用阈下浓度的蝙蝠葛碱进一步加剧了5-FU对细胞迁移的抑制;DAPI染色说明联合应用阈下剂量的蝙蝠葛碱加强了5-FU对细胞凋亡的诱导,Western blot实验表明联合应用阈下浓度的蝙蝠葛碱进一步抑制了cyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。结论蝙蝠葛碱可有效增强人乳腺癌MCF-7细胞对5-FU的敏感性。

蝙蝠葛碱;5氟尿嘧啶;乳腺癌;MCF-7细胞

乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤之一,占女性新发癌症总数的25%[1-2]。因此,乳腺癌的防治具有重要的价值与意义。化学疗法是治疗乳腺癌的一种重要手段,5氟尿嘧啶(5-FU)是一种常见的治疗乳腺癌化疗药物,但是通过临床观察表明,乳腺癌对5-FU的耐药性越来越突出[3]。辅助药物的开发和利用为解决化疗药物的耐药性提供了途径。

蝙蝠葛碱是从北豆根的根茎中提取的生物碱[4]。蝙蝠葛碱有抗心律失常、抗脑缺血、抗肿瘤以及逆转肿瘤多药耐药性等作用[5-6],有研究结果显示蝙蝠葛碱对人肺癌细胞QG-56、人膀胱癌细胞T24等有良好的抑制增殖作用,而且量效关系良好[7-8],其抗肿瘤的功能与抑制NF-κB通路有关[9],但是关于蝙蝠葛碱对于5-FU在乳腺癌中的增敏作用鲜有报道。本研究拟将阈下浓度的蝙蝠葛碱与5-FU联用,探究能否增强乳腺癌细胞对5-FU的化学敏感性,为解决5-FU临床耐药性找出可能的方法,以此提高化疗的敏感性,减少相关化疗药物的毒副反应,为进一步探讨其可能的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MCF-7细胞由中科院上海生物细胞所引进,蝙蝠葛碱购自美国Sigma公司,用二甲基亚砜(DMSO)配成5mg/mL贮存液,-20℃冰箱保存,实验时用DMEM高糖培养基稀释;DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、青、链霉素均购自美国Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司;5氟尿嘧啶(5-FU)购自美国Sigma公司。

1.2 MCF-7的培养与分组

体外细胞培养于含10%小牛血清以及100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养液中,37℃、5% CO2培养箱内培养,细胞长至对数生长期用于实验。

第一步筛选实验每组依次加入蝙蝠葛碱至终浓度为0.6 μg/mL、1.2 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL,空白对照组不加药。第二步细胞分为四组,空白对照组不加药(Blank组),其余三组分别加入终浓度为2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱(Dau组)、50 μg/mL的5-FU(5-FU组)、2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱和50 μg/mL的5-FU(Dau+5-FU组)。

1.3 MTT检测

取对数生长期的MCF-7细胞,配制成2×104/mL单细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔200 μL于培养箱中孵育过夜后加药。第一步筛选实验分为六组,每组5个复孔,调零孔只加入PBS;空白对照组不加药物,实验组分别加入药物培养,第二步实验一共分为四组,每组5个复孔,调零孔只加入PBS;空白对照组不加药物;实验组分别加入不同浓度药物。于培养箱中孵育24 h后每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),继续培养4 h后终止培养。吸掉孔内培养液于每孔加入100 μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度值。计算药物对细胞的抑制率。抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。上述实验重复3次。

1.4 Transwell实验

取对数生长期的MCF-7细胞,配制成1×105/mL单细胞悬液,取200 μL加入24孔板上室中,24孔板下室培养加入500 μL含各种药物的培养液,培养24 h后,甲醛固定,结晶紫染色后拍照观察。计数5个区域取平均值。

1.5 DAPI染色

调节对数生长期的MCF-7细胞,配制成2×105/mL单细胞悬液,六孔板中每孔2 mL,待细胞贴壁时依次加入含有药物的培养基,对照组不加药。继续培养24 h后,多聚甲醛固定20 min,Tritonx-100打孔5 min,在避光条件下加入DAPI染色5 min,用400倍荧光显微镜进行凋亡形态学观察。计数有效细胞,五个区域取平均值。凋亡率(%)=(1-实验组有效细胞数/对照组有效细胞数)×100%。

1.6 Western blot检测

处于对数取生长期的MCF-7细胞,配制成1×105/mL单细胞悬液,实验组分别加入2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱(Dau-1组)、50 μg/mL的5-FU(5-FU组)、5 μg/mL的蝙蝠葛碱(Dau-2组)、2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱和50 μg/mL的5-FU(Dau-1+5-FU组),对照组不加任何药物。按照提取蛋白-测定蛋白浓度-蛋白上样-电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-蛋白检测。得到图像并分析。

1.7 统计学分析

数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析,实验结果以均数±标准差表示,其中MTT筛选实验采用单因素方差分析,其余组采用双因素方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 蝙蝠葛碱联合5-FU对MCF-7细胞增殖的抑制效应

MTT筛选实验显示,2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱与空白对照组比较无明显差异,作为蝙蝠葛碱的阈下浓度(图1A)。Dau组对MCF-7细胞的抑制率为(5.12±1.23)%,与空白对照组比较对细胞增殖无明显抑制(P>0.05);5-FU组对癌细胞的抑制率为(30.25±2.23)%,与空白对照组比较,对细胞的增殖有一定的抑制效应(P<0.05);Dau+5-FU组对癌细胞的增殖抑制率升高为(60.25±2.25)%,与空白对照组、Dau组、5-FU组相比较,对癌细胞的增殖都有一定的抑制作用,说明阈下浓度的蝙蝠葛碱可以增强对癌细胞增殖的抑制(图1B)。

图1 MTT检测蝙蝠葛碱、5氟尿嘧啶作用于MCF-7细胞24 h后细胞增殖抑制率Figure 1 The inhibitory rates of proliferation were calculatod in MCF-7 cells treated with dauricine or 5-FU for 24 hNote:A.The inhibitory rate of dauricine in MCF-7 cells;B.The inhibitory rate of dauricine or 5-FU in MCF-7 cells.*P<0.05,compared to the control or 5-FU groups.

2.2 蝙蝠葛碱联合5-FU对MCF-7细胞迁移的影响

Dau组与空白对照组比较,对细胞迁移几乎没有影响;5-FU组与空白对照组比较,5-FU组对细胞的迁移有一定的抑制作用(P<0.05);Dau+5-FU组与5-FU组相对比,两者合用比单用5-FU对细胞的迁移抑制作用大大增强,差异具有统计学意义(P<0.05),说明阈下浓度的蝙蝠葛碱可以增强对癌细胞迁移的抑制(图2)。

图2 Transwell小室检测蝙蝠葛碱、5氟尿嘧啶对MCF-7细胞24 h后迁移的影响Figure 2 The cell migration of dauricine or 5-FU in MCF-7 cellsNote:A.Crystal violet staining;B.The statistical results of migration.*P<0.05,compared to the control or 5-FU groups.

2.3 蝙蝠葛碱联合5-FU对MCF-7细胞凋亡率的影响

应用DAPI染色观察各组药物对细胞凋亡的影响。当培养24 h后,Dau组与空白对照组比较时,对细胞凋亡没有明显影响;当5-FU组与空白对照组比较时,5-FU组对促进细胞凋亡有一定的效果(P<0.05);将蝙蝠葛碱与5-FU联用组与单用5-FU组比较时,对细胞诱导凋亡的能力大大增强(P<0.05),说明阈下浓度的蝙蝠葛碱可增强对癌细胞凋亡的诱导作用(图3)。

图3 应用DAPI染色检测蝙蝠葛碱、5氟尿嘧啶对MCF-7细胞24 h后凋亡的影响Figure 3 Effects of dauricine or 5-FU on apoptosis of MCF-7 cells after 24 hours treatment by DAPI stainingNote:A.MCF-7 cell DAPI staining;B.The DAPI staining MCF-7 cell apoptosis rate statistics,*P<0.05.

2.4 蝙蝠葛碱对MCF-7细胞cyclinD1和Bcl-2表达的影响

Dau-1组对cyclinD1和Bcl-2的表达与对照组相对比没有明显变化,Dau-2组对基因的表达产生了较为明显的影响。共用阈下浓度的蝙蝠葛碱(Dau-1)和5-FU组使cyclinD1和Bcl-2基因表达明显下降,而单用5-FU组对其相关基因表达影响较小,共用组比单用5-FU组和Dau-2组对基因表达的抑制明显。说明2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱增强了5-FU对乳腺癌细胞相关基因的表达,使增殖相关的cyclinD1基因和抗凋亡基因Bcl-2的表达进一步下降,即通过抑制细胞增殖,诱导凋亡来实现抗肿瘤的作用(图4)。

图4 应用Western blot分析蝙蝠葛碱、5氟尿嘧啶对MCF-7细胞作用24 h后cyclinD1和Bcl-2相关蛋白的表达Figure 4 The expression of Bcl-2 and cyclin D1 in MCF-7 cells.MCF-7 cells treated with dauricine or 5-FU for 24 h.The expression of cyclin D1 and Bcl-2 protein was determined by Western blot.

3 讨论

乳腺癌是女性发病率较常见的肿瘤,其中雌激素受体(ER)阳性乳腺癌占临床所有乳腺癌的60%~65%[10]。本研究选取的MCF-7细胞是研究乳腺癌的一种经典的细胞系,其雌激素受体为阳性。而且5-FU作用于MCF-7细胞是常规的乳腺癌药物治疗模型,常用作乳腺癌抗肿瘤药物开发相关研究的一线临床药物对照,其临床毒性作用和耐药性具有典型性[11]。因此,选择MCF-7细胞系与5-FU研究乳腺癌是具有代表性和现实意义的。

乳腺癌的发生发展与肿瘤的生长、侵袭转移密切相关,本研究选择MTT实验、细胞划痕实验来模拟肿瘤的生长和转移。细胞凋亡与肿瘤发生呈负相关,对肿瘤细胞凋亡的诱导率已经成为评价抗肿瘤药物疗效的可靠指标[12],本研究运用DAPI染色来评价药物对细胞凋亡诱导率的影响。

本研究发现2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱对肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡没有影响,可以排除抗肿瘤效果。可以作为蝙蝠葛碱的阈下浓度。综合实验结果,发现联合应用阈下浓度(2.5 μg/mL)的蝙蝠葛碱增强了5-FU的抗肿瘤效果,这与蝙蝠葛碱增强了乳腺癌对5-FU的化疗敏感性有关。

但是蝙蝠葛碱抗乳腺癌的药理及分子靶向机制研究甚少。本研究旨在探索蝙蝠葛碱体外的抗肿瘤可能的机制,我们发现蝙蝠葛碱抑制乳腺癌细胞的增殖、转移,诱导其凋亡,进一步发现蝙蝠葛碱的抗肿瘤作用是通过抑制NF-κB相关基因的表达完成的,具体表现为使增殖相关的cyclinD1基因和抗凋亡基因Bcl-2的表达下降。NF-κB是炎症和恶性肿瘤发生发展的一个至关重要的控制因子[13]。有实验显示NF-κB有着抑制细胞增殖、迁移和新生血管的生成,介导细胞死亡等多种生理效用[14]。蝙蝠葛碱使其下游靶基因cyclinD1和Bcl-2基因表达减少,从而发挥抗肿瘤作用。

本研究结果表明开发蝙蝠葛碱作为乳腺癌的辅助治疗药物是可能的。蝙蝠葛碱作为一种已经应用于临床的抗心律失常药,其药物安全性已得到充分的证实,其作为乳腺癌的辅助治疗药物具备基本的安全条件[15-16]。但是关于蝙蝠葛碱与5-FU的交互作用鲜有报道,而且蝙蝠葛碱是一种生物碱类成分,有较好的脂溶性,具有体内摄取快、发挥疗效快等优点[16],这为开发乳腺癌的辅助治疗药物提供了理论依据。

综上所述,本研究发现阈下浓度的蝙蝠葛碱可增强化疗药物的敏感性,为开发化疗药物的辅助用药提供了理论基础,但是开发可适用于临床的新药需要进一步的研究。

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Dauricineenhancesthesensitivityof5-fluorouracilinhumanbreastcancerMCF-7cells

LIHongyang1,SUNLiang2,JIANGXing3,YUANGuangjun3,LIUYan1

1.Department of Oncology,The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China;2.Department of Human Anatomy,Harbin Medical University;3.Jiamusi College of Heilongjiang University of Chinese Medicine

ObjectiveThe objective of this study was to investigate the effect of dauricine on the sensitivity of 5-fluorouracil(5-FU)in human breast cancer MCF-7 cells.MethodsMCF-7 cells were treated with 2.5 μg/mL of dauricine,50 μg/mL of 5-FU,or 2.5 μg/mL of dauricine with 50 μg/mL of 5-FU,the cell proliferation was measured by MTT assay.The cell migration was determined by Transwell assay;The cell apoptosis was detected by DAPI staining;The expression of cyclin D1 and Bcl-2 gene was examined by Western blot.ResultsThe results showed that the combination of subthreshold concentration of dauricine enhanced the inhibitory effect of 5-FU on proliferation in MCF-7 cells.The combined use of subcutaneous concentration of dauricine further aggravated the inhibitory effect of 5-FU on cell migration.The combination of subcapsular dauricine enhanced the induction of apoptosis by 5-FU.The combination of dauricine with 5-FU could inhibit the expression of cyclin D1 and Bcl-2 protein in MCF-7 cells.ConclusionDauricine can effectively enhance the sensitivity of 5-FU in human breast cancer MCF-7 cells.

Dauricine;5-Fluorouracil;Breast cancer;MCF-7 cells

黑龙江省自然科学基金面上项目(H201464);黑龙江省高校专项基金(003000166)

1.哈尔滨医科大学附属第四医院肿瘤内科(哈尔滨 150001);2.哈尔滨医科大学人体解剖学教研室;3.黑龙江中医药大学佳木斯学院

李红阳,男,(1989-),硕士研究生,从事肿瘤内科的研究。

刘艳,E-mail:1953786691@qq.com

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.05.001

(收稿:2017-01-17)

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