蒸汽爆破与碱法协同预处理对小麦秸秆结构及酶解的影响

何士成, 孙曼钰, 孙忠岩, 舒月力, 贾士儒, 钟 成

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学 生物工程学院，天津 300457)

HE Shicheng

蒸汽爆破与碱法协同预处理对小麦秸秆结构及酶解的影响

何士成, 孙曼钰, 孙忠岩, 舒月力, 贾士儒, 钟 成*

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学 生物工程学院，天津 300457)

以小麦秸秆为原料，采用蒸汽爆破预处理(SP)、碱法预处理(AP)以及两者协同预处理的方式分别进行预处理，通过扫描电镜(SEM)和傅里叶红外光谱(FT-IR)等方法，分析了预处理前后麦秆形态和化学成分的变化规律，研究了碱处理与蒸汽爆破的不同组合对麦秆成分及后续酶解的影响。研究表明：相比先碱法后蒸汽爆破预处理(ASP)，先蒸汽爆破后碱法预处理(SAP)的麦秆中纤维素质量分数高达88.15%，半纤维素和木质素质量分数分别减少到5.55%和4.13%。SEM和FT-IR分析结果及低底物浓度酶解结果表明，与其他预处理方法相比，SAP对麦秆的物理结构破坏程度更大，对木质素的去除效果更显著，纤维素的酶解转化率也明显优于其他预处理样品。以分批补料的手段对各预处理后麦秆进行高底物浓度酶解，SAP样品在底物质量浓度高达180 g/L时，酶解120 h,纤维素转化率可达80.53%。蒸汽爆破与碱处理的不同组合方式对麦秆的预处理效果不同，SAP的方法能极大的提高麦秆的酶解效率。

碱法预处理；蒸汽爆破预处理；麦秆；酶解

用化石原料作为能源，以及生产许多有益的产品是人类历史上的一个伟大的发现[1]。然而，由于化石原料是一种不可再生资源，难以满足日益增长的能源需求，近年来迫切需要寻求一种可再生的替代能源[2]。木质纤维原料是一种极具潜力的可再生生物质资源[3]，仅2015年全球小麦的产量就达250万吨[4]。大部分小麦秸秆(麦秆)被直接燃烧处理，既浪费了资源也污染了环境。因此通过适当的方法将麦秆资源化利用具有极其重要的意义。木质纤维原料是一种高度结晶、结构稳定的超分子聚合物，主要由约40%～50%的纤维素、15%～30%的半纤维素以及15%～30%的木质素组成[5]。在植物细胞壁中，木质素填充于纤维素和半纤维素之间，通过氢键和共价键与糖类聚合物连接在一起[6]。这种结构严重阻碍了纤维素的降解，合适的预处理过程，是打破这种抗性的有效手段。常用的预处理方法有物理法、化学法和物理化学法等，其中碱法预处理是一种备受关注的化学预处理方法，碱法预处理可有效去除原料中的部分木质素，提高纤维素酶的可及性；而蒸汽爆破预处理方法是一种常用的物理化学方法，该方法能够有效去除半纤维成分，破坏木质纤维原料的物理结构。单一的预处理方法对木质纤维原料的预处理效果往往不是很令人满意。Zhu等[7]曾将蒸汽爆破和碱性过氧化氢(AHP)方法结合预处理杜仲，预处理后的杜仲中葡聚糖、木聚糖和木质素的质量分数分别约为82%、1.7%和2.4%，酶解转化率最高达91.69%。本研究将碱法与蒸汽爆破法联合，重点研究了两种方法的不同组合方式对麦秆中三大素组成的影响，并对预处理后的麦秆进行酶解，旨在为麦秆高效资源化利用提供参考数据。

1 实 验

1.1原料、试剂与仪器

麦秆来自山东省枣庄市，自然风干，剪成2～3 cm小段，粉碎后过筛，选取粒径≤0.83 mm的原料作为未处理麦秆(UW)样品。

纤维素酶(43.21 FPU/mL)，湖南尤特尔生物试剂有限公司;β-葡萄糖苷酶(372 IU/mL)、木聚糖酶(250 IU/mL)、D(+)-葡萄糖、D-(+)-木糖和L-(+)-阿拉伯糖标准品,Sigma公司；其余试剂均为市售分析纯。

FZ102微型植物粉碎机；JSM-IT300扫描电镜(SEM)；BRUCKER傅里叶红外光谱(FT-IR)仪；Agilent1200高效液相色谱(HPLC)仪。

1.2麦秆预处理

1.2.1碱法预处理(AP) 将剪成小段的100 g麦秆与0.1 mol/L NaOH溶液按料液比1∶20(g:mL)混合，于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃预处理1 h。预处理后的样品经过纱布过滤，并用大量的去离子水洗涤至洗液呈中性，过滤，弃去上清液，保留固体残渣，待晾干后粉碎并过筛，取粒径≤0.83 mm部分备用。

1.2.2蒸汽爆破预处理(SP) 取剪成小段的麦秆200 g，于5 L反应罐中进行蒸汽爆破处理，蒸汽压力2.2 MPa，保压时间5 min。蒸汽爆破预处理后的麦秆用大量的去离子水洗涤至洗液呈中性，过滤，弃去上清液，保留固体残渣，待晾干后粉碎并过筛,取粒径≤0.83 mm部分备用。

1.2.3碱法-蒸汽爆破协同预处理(ASP) 麦秆经1.2.1节碱处理后再经过蒸汽爆破预处理，预处理后的麦秆用大量的去离子水洗涤至洗液呈中性，过滤，弃去上清液，保留固体残渣，待晾干后粉碎并过筛，取粒径≤0.83 mm部分备用。

1.2.4蒸汽爆破-碱法协同预处理(SAP) 麦秆经过1.2.2节蒸汽爆破预处理后再经过碱法预处理，预处理后的麦秆用大量的去离子水洗涤至中性，过滤，弃去上清液，保留固体残渣，待晾干后粉碎并过筛，取粒径≤0.83 mm部分备用。

1.3不同预处理对麦秆酶解的影响

1.3.1酶解实验及酶解效率 酶解反应的总体积为20 mL，在100 mL的三角瓶中进行。酶解实验所使用的底物分别为UW、AP、SP、ASP和SAP；底物质量浓度(以纤维素质量计，下同)为10 g/L;纤维素酶用量为15FPU/g(以纤维素质量计，下同)，β-葡萄糖苷酶用量为129 IU/g，木聚糖酶用量为 87 IU/g；反应温度50 ℃，摇床转速180 r/min。

在酶解过程中取样，用HPLC测酶解液中的糖质量浓度，并计算纤维素的转化率(YC)和木聚糖的转化率(YX)。

式中：cg—酶解液中葡萄糖的质量浓度，g/L；cX—酶解液中木糖的质量浓度，g/L；V—酶解液体积，mL；mg—酶解初始条件下纤维素的质量，g；mX—酶解初始条件下木聚糖的质量，g。

1.3.2初次补料时间的确定 初始底物质量浓度为40 g/L，纤维素酶添加量为35 FPU/g时。各批次样品分别在酶解6、12和24 h进行第一次补料。补加底物的量为初始底物质量浓度的一半，同时补加相应体积的酶，其他实验条件同1.3.1节。

2.2 入院血常规检测 入院当天行血常规检查，死亡组白细胞、红细胞、血红蛋白均低于存活组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

1.3.3分批补料酶解 分别在酶解进行6、12和24 h各补加底物一次，之后再每间隔24 h补加底物一次。每次补料后使体系中底物质量浓度依次增加20 g/L，同时补加相应体积的酶。其他实验条件同1.3.1节。

1.4预处理前后麦秆的结构和成分分析

1.4.1扫描电镜(SEM)分析 用扫描电镜观察预处理前后麦秆的表面结构。样品观察前先喷金处理，电压5～15 kV。

1.4.2红外光谱(FT-IR)分析 用傅里叶红外光谱仪测定AP、SP、ASP和SAP这4种预处理前后麦秆的成分变化，仪器分辨率4 cm-1，波数范围400～4000 cm-1，扫描次数16次，样品处理采用KBr压片法。

1.4.3成分分析 预处理前后麦秆中的纤维素、半纤维素(木聚糖)和酸不溶性木质素的含量参照美国可再生能源实验室(NREL)的实验方法进行测定[8]。

2 结果与分析

2.1不同预处理方式对麦秆结构和成分的影响

2.1.1麦秆组成成分 如表1所示，与未处理麦秆(UW)相比，碱法预处理(AP)去除了近15个百分点的木质素和少许半纤维素，使纤维素质量分数提高到65.08%。只进行蒸汽爆破预处理(SP)时，原料中半纤维素的质量分数下降十分明显，由27.77%下降到3.49%，使得纤维素和木质素的含量均相应升高。根据文献报道，木质纤维原料在蒸汽爆破过程中会由于高温的作用导致半纤维素降解[9]，半纤维素成分被去除后，纤维素的比表面积增加，进而提高纤维素酶的可及性，同时高温过程也会引起纤维素成分的部分降解[10]。然而，高温下由于木质素会重新分布在纤维表面使得蒸汽爆破对原料中木质素的去除效果不明显[11]。与单独碱法预处理相比，ASP只去除了原料中少量的半纤维素，木质素质量分数反而稍微提高约4个百分点。可能是在经过碱处理后，原料颗粒内部间隙中部分碱中和了蒸汽爆破过程中半纤维素乙酰基形成的乙酸，从而削弱了有机酸对半纤维素的降解作用。

表1 不同方法预处理后麦秆主要成分含量Table 1 Compositional contents in wheat strawpretreated by different pretreatment methods

1) UW:未处理麦秆untreated wheat straw; AP:碱法预处理alkaline pretreatment; SP:蒸汽爆破预处理steam explosion pretreatment； ASP: 碱法-蒸汽爆破协同预处理pretreatment of alkali-steam explosion； SAP: 蒸汽爆破-碱法协同预处理pretreatment of steam explosion-alkali

据相关研究报道，碱法预处理可使木质纤维原料中木质素和半纤维素之间的分子间酯键发生皂化反应，使得纤维素、半纤维素和木质素间的交叉连接作用减弱，从而使木质纤维原料的孔隙度增加[14]。碱法预处理可使纤维素膨胀，聚合度下降，增大纤维素比表面积，使木质素和碳水化合物之间的连接断裂，破坏木质素结构[15]。因此，经过碱法预处理后，大部分的木质素被去除。实验证明，在半纤维素和木质素成分去除方面，SAP的效果要优于ASP的效果。

2.1.2SEM分析 预处理前后麦秆样品的SEM图片见图1。

图1 不同方法预处理前后麦秆SEM图片

图2 不同方法预处理后麦秆FT-IR图谱Fig.2 FT-IR spectra of wheat straws pretreated by different pretreatment methods

从图1可以看出，碱法预处理(AP)的麦秆样品表面仍比较光滑致密，物理形态变化不大，碱处理主要去除了样品中的木质素成分；相比之下，经蒸汽爆破预处理(SP)麦秆样品的物理结构变化较大；经过蒸汽爆破处理后又经过碱处理(SAP)的麦秆样品物理结构变化更显著，该组合预处理方法对麦秆物理结构的破坏作用更大，表面褶皱更明显，有的只留下一些网状的物理结构，结合成分分析的结果，该组合预处理方法去除了样品中大部分的半纤维素和木质素成分，被保留下来的主要是纤维素成分。相比SP的麦秆样品，ASP的麦秆样品的物理结构变化不明显；与SAP的麦秆样品相比，ASP预处理的效果似乎并不理想。蒸汽爆破过程中产生的酸性物质使半纤维素解聚，碱法预处理后麦秆中残留的碱中和了蒸汽爆破过程中产生的酸性物质，使得预处理效果变差。

从FT-IR分析结果也可以得出，SAP无论是对纤维素的保留还是对半纤维素和木质素的去除都表现出较优的效果。

图3 不同预处理对麦秆酶解效果的影响Fig.3 The effect of different pretreatments on enzymatic hydrolysis of wheat straw

2.2不同预处理方式对麦秆酶解的影响

2.2.1酶解效率 预处理前后的麦秆在底物质量浓度 10 g/L 的条件下酶解结果见图3。由图可知，经过各种预处理后的麦秆样品的纤维素转化率均显著高于未处理麦秆。然而，SAP处理之后的麦秆对应的纤维素转化率又明显优于其他预处理，酶解72 h时，SAP样品的纤维素转化率约75%，且仍有缓慢升高的趋势；而经过AP、ASP和SP这3种方式预处理的麦秆在酶解24 h后，纤维素的转化率已趋于平稳，SAP样品纤维素的转化率较高得益于SAP去除了绝大部分的半纤维素和木质素，使纤维素酶的可及性提高，酶解效率提高。

2.2.2初次补料时间 在初始底物质量浓度40 g/L和酶用量35FPU/g的基础上，以SAP为底物，采用分批补料进行酶解，初次补加底物的量为初始底物质量浓度的一半。初次补料时间对酶解效果的影响见图4。

图4 不同初次补料时间下的酶解效果

从纤维素转化率来看，在每次补料后纤维素的转化率都要经过一个减缓过程，这是由于底物的加入使得酶解体系中的固体含量升高，酶解效果降低。另外，新加入的底物原料需要一段时间才能转化出对应的单糖产物，因此使酶解转化率增长缓慢。从葡萄糖质量浓度的增长趋势也可以看出，在每次补加底物之后，糖质量浓度较其它组有明显的增长，而增加的这部分糖质量浓度来源于新补加进底物的转化，在酶解进行48～72 h时，各体系中单糖质量浓度和转化率已基本一致。为了缩短酶解的总时间，可考虑增加补料次数以提高酶解体系最终固体含量，故选择6 h作为初次补料的时间。

图5 分批补料酶解过程中酶解时间与纤维素转化率的关系Fig.5 The relationship between time and the conversion of cellulose in the process of fed batch enzymatic hydrolysis

2.2.3分批补料酶解 为了评价各种预处理方法得到的样品在分批酶解过程中效果的差异，分别在酶解进行6、12和24 h各补加底物一次，之后再每间隔24 h补加底物一次。每次补料后使体系中底物质量浓度依次增加20 g/L，同时补加相应体积的酶，实验结果如图5所示。AP样品的纤维素转化率明显低于其他预处理样品，这是因为AP样品中保留的半纤维素和木质素成分较多，随着底物质质量浓度的增加，随之引入过多的半纤维素和木质素成分，加之酶解体系中固体增加，酶解体系的黏滞阻力增大，使得酶解效率降低。而SP样品保留了过多的木质素，补料的同时会引起较多的木质素积聚，过多积累的木质素又会造成酶的无效吸附，所以使得AP、SP样品在酶解72 h时，即底物质量浓度为 140 g/L 时，接下来的补料过程使酶解体系呈现固体状态，无法进行后续的酶解过程。类似的原因，ASP样品在酶解96 h后，无法进行后续的酶解。然而，经过SAP预处理后，麦秆中的半纤维素和木质素基本被去除，纤维素的质量分数高达88%以上，酶解进行120 h时，酶解体系仍然呈现明显的流体状态，纤维素转化率达到80.53%，此时仍然具备继续补料酶解的条件。以上实验证明，SAP样品更适合进行高底物质量浓度的酶解，为产生高浓度的可发酵糖提供有利条件。

3 结 论

3.1SAP样品的纤维素、半纤维素(木聚糖)和木质素的质量分数分别为88.15%、5.55%和4.13%，表明SAP可以有效脱除木质素，得到纤维素含量高的木质纤维原料。

3.2在底物质量浓度(以纤维素质量计，下同)为10 g/L的酶解过程中，SAP样品的酶解效率明显高于其他预处理后样品，表明SAP可有效增强预处理后麦秆的酶解效率。

3.3在高底物质量浓度分批补料酶解过程中，酶解120 h时SAP样品的底物质量浓度可达到180 g/L，纤维素转化率达到80.53%，酶解体系仍呈流体状态，仍然具有继续补料酶解的条件，表明SAP样品更适合高底物质量浓度的酶解，且为获得高浓度可发酵糖提供有利条件。

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The Effect of Integrated Processes of Steam Explosion and Alkaline Pretreatment on the Structure of Wheat Straw and Its Enzymatic Hydrolysis

HE Shicheng, SUN Manyu, SUN Zhongyan, SHU Yueli, JIA Shiru, ZHONG Cheng

(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)

Various combined processes of steam explosion and alkaline pretreatment were experimentally compared and evaluated on wheat straw materials. The morphological characterizations of pretreated wheat straw were performed by scanning electron microscope and FT-IR spectroscopy, to qualitatively determine the composition changes of pretreated wheat straw. Comparing to the single process or the combination of alkaline pretreatment followed by steam explosion(ASP), the steam explosion followed by alkaline process(SAP) pretreatment removed most of lignin, degraded hemicelluloses, and incurred a higher surface area of the cellulose-rich substrates. And the remaining contents of cellulose, xylan and lignin in SAP sample were 88.15%, 5.55%, 4.13%, respectively. Moreover, SAP enhanced the fed batch enzymatic hydrolysis of cellulose-rich substrates to a maximum value of 80.53% even at the high cellulose loading of 18%. The results indicated that the SAP process is advantageous scheme for the enhancement of enzymatic efficiency.

alkaline pretreatment；steam explosion pretreatment；wheat straw；enzymatic hydrolysis

2017- 01- 07

公益性行业(农业)科研专项(201503135-15)

何士成(1991— ),男,山东枣庄人，硕士生，主要从事木质纤维素预处理及酶解研究

*通讯作者：钟 成，教授，博士生导师，主要从事纤维素的生物合成代谢与降解机理研究；E-mail: czhong@tust.edu.cn。

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.05.017

TQ35

A

0253-2417(2017)05- 0126- 07

何士成,孙曼钰,孙忠岩,等.蒸汽爆破与碱法协同预处理对小麦秸秆结构及酶解的影响[J].林产化学与工业，2017，37(5)：126 - 132.