原油污染土壤中蒿属植物与丛枝菌根真菌共生性研究*

山宝琴 张永涛 李 茜 白雪梅

(延安大学石油工程与环境工程学院，陕西 延安 716000)

原油污染土壤中蒿属植物与丛枝菌根真菌共生性研究*

山宝琴 张永涛 李 茜 白雪梅

(延安大学石油工程与环境工程学院，陕西 延安 716000)

通过盆栽试验研究原油污染条件下艾蒿(Artemisiaargyi)、黄花蒿(Artemisiaannua)、猪毛蒿(Artemisiascoparia)和白叶蒿(Artemisialeucophylla)4种蒿属植物根系丛枝菌根(AM)真菌侵染率及形态特点。每种植物各设0、5、10、20、40g/kg5种原油污染质量浓度，分离鉴定植物根围AM真菌，测定孢子密度、菌丝侵染率、丛枝侵染率以及植物株高和干质量。结果表明，原油污染条件下蒿属植物根围共分离鉴定出2属10种AM真菌，7种属于球囊霉属 (Glomus)， 3种属于无梗囊霉属(Acaulospora)，其中地球囊霉(Glomusgeospora)为优势种，4种植物中艾蒿根围AM真菌多样性最丰富。形态观察结果表明，4种蒿属植物的根系都具有疆南星型菌根结构。AM真菌孢子密度、菌丝侵染率和丛枝侵染率都与原油浓度呈显著正相关；植物株高和干质量随原油浓度增加而下降。

原油污染土壤 丛枝菌根真菌 蒿属植物 共生

陕北地区油气资源丰富，长期开采及贮运加工造成油田土壤污染严重[1]，原油渗透污染易造成土壤黏结，透水性降低，进入土壤的各类多环芳烃具有超强生物毒性，难去除、难降解，且浓度越大迁移深度越大[2]，给当地生态带来危害。自然条件下，土壤中原油类污染物的降解是地被植物与其根际微生物共生互作的过程[3]。丛枝菌根(AM)真菌广泛分布于陆地生态系统中，AM真菌菌丝与高等植物营养根系共生而形成菌根。菌根具有改善宿主植物的营养状况、增强宿主的抗逆性、加快污染土壤修复等功能[4]，并能增强污染土壤中农产品的质量安全性[5]。因此，研究陕北适生植物及其根围AM真菌多样性，尤其是原油污染条件下AM真菌侵染的特点，对于采用生物技术修复污染土壤，维持植物的多样性和生态系统的稳定性具有重要意义。

菊科蒿属植物是陕北油田荒地最常见的植物种类，本研究选取艾蒿(Artemisiaargyi)、黄花蒿(Artemisiaannua)、猪毛蒿(Artemisiascoparia)和白叶蒿(Artemisialeucophylla)4种抗逆性强、适应性广、耐瘠薄草本植物，这4种植物均属自然条件下陕北退化土壤恢复的先锋物种，作为原油污染土壤生物修复材料具有一定研究价值。目前，生物修复技术方兴未艾，国外已有通过投加微生物修复原油污染土壤的报道[6_7]，国内针对生物修复材料的研究也极为广泛[8_9]，但尚未有针对在陕北分布极为广泛的蒿属植物及其根围AM真菌的研究。本研究采用盆栽方法，选用4种蒿属植物，并设定不同浓度原油污染的土壤，测定原油污染协迫条件下蒿属植物根围AM真菌的多样性、AM真菌侵染形态，并分析AM真菌对宿主植物生长的影响，为后期利用乡土植物及根围AM真菌提高修复效率并降低修复成本积累数据，为陕北原油污染土壤AM真菌生物修复技术的应用提供科学依据。

表1 不同质量浓度原油污染土壤的理化性质1)

注：1)字母不同表示在p<0.05水平上差异显著，字母相同表示在p<0.05水平上差异不显著，表3同。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤取自延安市杨家岭植物园，自然风干后研磨过2 mm筛子，加入300 g细沙混匀以增强土壤通透性，每盆土总质量约1.2 kg。原油取自延长石油集团七里村采油厂，不同质量浓度原油污染土壤的理化性质见表1。供试植物种子于2014年秋季野外采集并低温保存，试验时种子置于恒温箱中培养，发芽后移至花盆中。

1.2 试验方案

本研究前期调查结果表明，陕北污染土壤中总石油烃质量浓度约为0.168～22.920 g/kg，因此设定原油添加质量浓度分别为0、5、10、20、40 g/kg。

2015年5月进行盆栽试验，选取艾蒿、黄花蒿、猪毛蒿和白叶蒿4种蒿属植物为研究对象，每种植物各设0、5、10、20、40 g/kg 5种原油质量浓度，各3组平行，共60盆，其中原油质量浓度为0 g/kg的为无污染对照。原油按1∶1(体积比)溶解于石油醚中，然后倒入土壤充分混匀，静置7 d后播种植物。供试花盆直径和深度均为20 cm，每盆初始播种30粒，出苗后间苗保持在20棵/盆。花盆随机置于向阳处、室温、自然采光条件下生长，定时移动交换位置以保证植物采光均匀，每天2次浇灌。培养60 d后，分别测定植物株高，采集植物须根测定菌丝侵染率和丛枝侵染率，采集植物根际土壤测定AM真菌孢子密度，然后仔细连根拔出每盆植物，漂洗干净后迅速烘干，测定每盆植物的干质量。

1.3 主要测定方法

1.3.1 AM真菌侵染率测定

收集4种植物细根根段，参考文献[10]的方法测定组织内菌丝的侵染发育状况，每种植物约25条细根置于Olympus BXSO显微镜下观测根系的AM真菌的菌丝侵染率和丛枝侵染率，菌丝侵染率计算公式见式(1)，丛枝侵染率计算公式见式(2)。

菌丝侵染率=(菌丝侵染根段数/被检根段总数)×100%

(1)

丛枝侵染率=(丛枝侵染根段数/被检根段总数)×100%

(2)

1.3.2 AM真菌孢子密度

用湿筛倾注蔗糖离心法[11]对10 g风干土壤中的AM真菌孢子进行分离，在体视镜下挑取AM真菌孢子对孢子进行计数。AM 真菌孢子密度为1 g风干土壤中含有的AM 真菌的孢子数，相对多度计算公式见式(3)，频度计算公式见式(4)。

相对多度=某1个种的孢子数/总的孢子数×100%

(3)

频度=某1个种出现的样品数/总样品数×100%

(4)

1.3.3 AM真菌鉴定

挑取孢子置于载玻片上，加浮载剂(如水、乳酸甘油、聚乙烯醇/乳酸甘油、Melzer’s试剂等)在显微镜下观察，根据SCHECK等[12]的《外生菌根鉴定手册》和国际AM真菌保藏中心(INVAM)提供的种的描述及图片，并参阅有关鉴定材料和近年来发表的新种等进行种属检索、确定。

1.4 数据处理

用Excel处理试验数据并绘图，用SPSS 18.0生物统计软件进行单因素方差分析和Pearson双变量相关分析。

表2 原油污染土壤中蒿属植物根围AM真菌多样性

图1 AM真菌孢子形态Fig.1 Spore morphologies of AM fungi

2 结果与讨论

2.1 AM真菌多样性

在所有试验土壤样品中分离并鉴定AM真菌共10种，其中球囊霉属(Glomus)7种，无梗囊霉属(Acaulospora) 3种。优势种为地球囊霉(Glomusgeospora)，出现的频度为100.0%。艾蒿根围AM真菌种类最多，黄花蒿根围未分离出具疱球囊霉(Glomuspustulatum)，猪毛蒿根围未见摩西球囊霉(Glomusmosseae)、具疱球囊霉和蜜色无梗囊霉 (Acaulosporamellea)，白叶蒿根围未见摩西球囊霉和具疱球囊霉，原油污染土壤中蒿属植物根围AM真菌多样性情况见表2，分离出的AM真菌孢子形态见图1。原油污染土壤中蒿属植物根围AM真菌多样性丰富，且不同植物根围多样性存在差异。与陕北自然条件下植物根围AM真菌多样性相比[13]，原油污染土壤AM真菌种类有所减少，但优势种的频度和相对多度很高，这意味着个别菌种对原油具有强适生性和抗逆性。

2.2 原油污染土壤中蒿属植物根系AM真菌侵染形态

AM真菌有两个最明显特征：一是能与植物互惠共生；二是在植物根细胞内形成二叉的丛枝结构，并由此得名[14]。4种蒿属植物的根系都具有疆南星型菌根结构。从原油质量浓度为40 g/kg的土壤中分离出的艾蒿根系AM真菌共生体结构见图2。由图2可知，在宿主幼嫩须根中形成大量胞间菌丝，在较为成熟的须根内沿皮层细胞纵向延伸形成无隔菌丝。菌丝侵入皮层细胞内后连续二叉分支形成典型花椰菜状丛枝。从直径小于0.5 mm的艾蒿须根中可观察到丛枝在根皮层细胞中有成片分布，而无污染对照土壤中未见。

图2 艾蒿根系AM真菌共生体结构Fig.2 Symbiosis structures of AM fungi in root system of Artemisia argyi

表3 不同原油质量浓度土壤中植物生物量和AM真菌侵染率

2.3 不同浓度原油土壤中植物生物量和AM真菌侵染率

在盆栽条件下，设定原油浓度为唯一差异因子，不同质量浓度原油污染土壤中植物生物量和AM真菌侵染率见表3。由表3可知，4种植物根围AM真菌孢子密度随原油浓度的增加均总体显著增加，原油质量浓度为40 g/kg时AM真菌孢子密度达到最大。耿春女等[15]研究发现，油场周围原油污染土壤中AM真菌孢子密度随原油浓度增加而下降，这很可能是由于野外条件下，高浓度污染土壤本身鲜有存活植物，缺乏真菌生长的根系微环境。本研究观测到的AM真菌对原油中的石油烃污染物有很强的耐受力，石油烃毒性能使土壤中许多生物致死，但这些生物的腐化可能反而为AM真菌生长提供了养分。王晨霞等[16]认为，轻度原油污染能刺激根区土壤微生物的生长，且土壤微生物对碳源的利用能力增强。JUSSI等[17]的菌根根际假说也认为，石油烃污染的土壤中富含易利用的富碳基质，可促进植物根际的菌群对碳源的利用。本研究中AM真菌孢子密度随原油浓度的增加而总体显著增加，说明其并未受到高水平原油污染毒害作用的抑制。高浓度原油污染土壤易粘结成块，水分凝结成珠难以入渗，AM真菌和植物的共生能促进植物对土壤中水分和氮、磷等养分的吸收，从而促进植物在逆境中生存和生长[18]。在原油污染土壤中，AM真菌可以改善宿主对矿质营养的利用[19_20]，同时植株根系降解作用减弱了原油污染对土壤中微生物的胁迫，维护了微生物的生长环境[21]，因此在生物修复原油污染土壤的过程中，两者间的共生支撑作用不容忽视。

表4 AM真菌侵染率与其他因子相关性分析1)

注：1)**表示p<0.01水平上有极显著相关性。

随着原油浓度增加，4种蒿属植物的菌丝侵染率总体显著增加。菌丝侵染率是表征AM 真菌与植物亲和力的指标，说明原油污染胁迫条件下，宿主植物对AM真菌的依赖性显著增强。原油质量浓度≥20 g/kg条件下，植物根系中丛枝侵染率显著高于无污染对照，而且在艾蒿须根中观察到成片分布的丛枝。真菌对宿主植物的侵染也随着原油浓度的增加而加大，两者呈显著正相关，这表明胁迫条件下植物与真菌相互间依赖性增加，其偏利共生关系得到强化。丛枝是植物与AM真菌之间进行能量与物质交换的主界面，丛枝的丰富程度与发生强度，反映出菌根共生体功能单位的数量和真菌代谢潜力[22]。丛枝寿命很短，一般从形成到被植物消化掉只有1～2周[23]。AM真菌侵染率的相关研究大多以菌丝侵染率为代表，部分原因是由于丛枝侵染难以观察且数量很少，本研究中艾蒿根系里丛枝侵染率最强，丛枝侵染形态典型并且清晰，尤其随原油浓度增加而增加，说明随着原油污染胁迫程度增加，植物与AM真菌之间物质交换密集，代谢频繁，宿主植物更多地依赖AM真菌来抵抗周边毒性环境。采自四川遂宁原油污染土样的分析也表明，艾蒿具有修复原油污染土壤的潜在优势[24]。

由表3可知，艾蒿和白叶蒿的株高和干质量都是在原油质量浓度达到20 g/kg后有显著下降；黄花蒿株高在原油质量浓度达到10 g/kg后开始显著下降，干质量在原油质量浓度达到20 g/kg时开始显著下降；猪毛蒿株高在各浓度间无显著差异，干质量在原油质量浓度达到10g/kg时开始显著下降。4种植物的株高和干质量最小值都出现在40 g/kg。由此可见，植物生长受到高浓度原油污染的毒害，即使有真菌菌群的共生支持，生长情况也明显受抑。

结合表2和表3，推荐艾蒿/地球囊霉组合为陕北原油污染土壤生物修复材料。

2.4 相关性分析

AM真菌侵染率与其他因子相关性分析结果见表4。由表4可知，AM真菌孢子密度、菌丝侵染率和丛枝侵染率均与土壤中原油浓度及总有机碳、速效氮和速效磷含量极显著正相关，但是和速效钾、脲酶活性极显著负相关。前人研究也表明，土壤脲酶活性受到原油污染明显的抑制[25_26]。脲酶活性表征土壤中有机氮向有效氮转化，活性低则土壤氮素供应状况不好。土壤中速效钾的含量也与AM真菌侵染率显著负相关。高翔[27]认为，污染土壤中植物吸收钾的能力降低，但接种菌根真菌可有效地提高宿主植物对钾的吸收。

3 结 论

(1) 原油污染条件下，蒿属植物根围共分离鉴定10种AM真菌，地球囊霉为优势菌种，4种植物中艾蒿根围AM真菌多样性最丰富。AM真菌对石油烃污染物有很强的耐受力，真菌孢子密度随原油浓度的增加而总体显著增加。

(2) 4种蒿属植物的根系都具有疆南星型菌根结构，丛枝侵染率在艾蒿根系中最强，并随原油浓度升高而增加。结合植物生物量考虑，推荐艾蒿/地球囊霉组合为陕北原油污染土壤生物修复材料。

(3) AM真菌菌丝侵染率和丛枝侵染率与原油浓度呈显著正相关，随着原油浓度的增加而加大。但植物生长受到高浓度原油污染的毒害，即使有真菌菌群的共生支持，生长情况也明显受抑。

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SymbioticrelationshipbetweenArtemisiaspeciesandarbuscularmycorrhizafungiincrudeoilcontaminatedsoil

SHANBaoqin，ZHANGYongtao，LIQian,BAIXuemei.

(CollegeofPetroleumEngineeringandEnvironmentalEngineering,Yan’anUniversity,Yan’anShaanxi716000)

The infection rates of arbuscular mycorrhizae (AM) fungi of root system ofArtemisiaargyi，Artemisiaannua，ArtemisiascopariaandArtemisialeucophyllawere measured in crude oil contaminated soil by pot experiment,as well as the morphological characteristics of AM fungi. Crude oil concentration was set at 0,5,10,20 and 40 g/kg respectively. The AM fungi were isolated and identified,and spore densities,hyphal rates,arbuscular rates,plant heights and dry weights were measured. The results showed that 10 species of AM fungi in two genera were isolated and identified from contaminated soil,7 species of them belong to the genusGlomus,and other species belong to genusAcaulospora.Glomusgeosporawas the dominant species. The diversity of AM fungi in the rhizosphere ofArtemisiaargyiwas larger than that of others. Morphological observation results showed that mutualistic symbiont named arum_type mycorrhiza was observed in root system of each kind of host plants. The spore densities,hyphal rates and arbuscular rates of AM fungi were all significantly positive correlated with the crude oil concentration. Plant heights and dry weights decreased with the increase of crude oil concentration.

crude oil contaminated soil; AM fungi;Artemisiaspecies; symbiosis

10.15985/j.cnki.1001_3865.2017.01.011

2016_03_01)

山宝琴，女，1970年生，博士，副教授，主要从事石油污染土壤生物修复方面的研究。

*陕西省教育厅科研项目(No.16JK1855);延安市科技局项目(No.2014KS_03);延安大学引导项目(No.YD2015_14)。